单克隆细胞鉴定分析
X染体失活的多态性分析
根据雌性细胞中两条X 染体上甘油磷酸激酶( PGK) 基因多态
性进行克隆性分析
原理与方法：
基因多态性
染体基因多态性为基础的克隆性分析基于女性体细胞X染体上葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因多态性的同功酶分析是应用最早的克隆性检测。应用甲基化敏感的限制性内切酶也能明确X 染体的活性状态。有活性的X染体可被甲基化敏感的限制性内切酶切开，而甲基化修饰的位点则不能被切开。另外，雌性体细胞内的一对X染体上的许多位点有多态性，可以通过限制性片段长度多态性检测区分X p和X m。Vogelstein等曾首先应用次黄嘌呤核苷转移（HPRP）和磷酸甘油激酶（PGK）基因的多态性结合放射性同位素标记的核酸杂交进行克隆性分析。1991 年，Gilliland等把上述PGK位点上HPRP检测与聚合酶链反应（PCR）技术结合起来，建立起以PCR为基础的克隆性检测方法。文献［1］显示了PCR 基因位点的结构。
应用他们设计的巢式引物进行两轮扩增，得到的产物为530bp，包含有此基因的第8个HpaII酶切位点和1个Bst XI酶切多态性位点。后者位于该片段的第433bp处，属于单核苷酸多态性（SNP）。雌性每个体细胞内的一对PKG 等位基因中的一个通过甲基化失活。在PCR扩增之前用甲基化敏感的限制内切酶进行消化，活性的PKG基因被切断，而失活的PKG基因得以保留。因而只有甲基化了的PKG基因被扩增。如果这一被扩增的基因片段中含有Bst XI酶切位点，用该酶处理PCR产物后切去97bp，电泳时显示出433bp 的一条带；如果扩增产物中不含有Bst XI酶切位点，电泳后显示出530bp一条带。来自单克隆起源肿瘤组织的基因组DNA 经上述一系列处理后，琼脂糖电泳仅显示出一条带；而多克隆起源的组织内失活的等位基因不同，两个PGK基因都得到了扩增，在凝胶上出现两条带。
步骤：
（1）标本来源和DNA提取：采用有限稀释法从Hca-P细胞株分选出有单个细胞不断生长成的细胞株。
参考文献应用DNA提取试剂盒按照说明书进行基因组DNA的抽提，用核酸定量一测定DNA 浓度及纯度。
（2）HpaII限制性内切酶消化及DNA扩增用于PCR的两队引物其序列见［1］各细胞株的基因组DNA分别经HpaII处理12h[HpaII5ul,10g/L牛血清白蛋白（BSA）0.2ul,10*缓冲液2ul，DNA样品10ul,加去离子水至总体积20ul，37℃]，进行巢式PCR扩增。反应体系为50ul。第一轮反应：预变性后94℃变性40s,58℃淬火50s,72℃延长1min,共35个循环，72℃延长15min,第二轮反应的淬火温度为56℃。
(3) Bst XI限制性内切酶消化及数据分析：扩增产物经Bst XI处理8-10h(Bst XI5U,10g/L BSA 0.2ul，10*缓冲液2ul,扩增产物10ul,加去离子水至20ul,47℃) ，20g/L琼脂糖凝胶电泳，用100bpDNA分子量标志确定扩增产物的大小，0.2mg/L溴化乙锭染，UVP凝胶分析系统记录数据并应用相应软件（Lab Work3.0，UVP）比较HpaII消化前后530bp或433bp 条带荧光强度，其可比强度有明显改变（减低一半以上）时才认为有意义。
【1】王淑芳，苏勤，朱少军，等4 多发性子宫平滑肌瘤的克隆性4 中华
病理学杂志，2002,31:107-111.

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