轴突蛋白NRXN1基因单核苷酸多态性与汉族儿童孤独症的关联
余金丹、姚丹、何雪、赵正言
浙江大学医学院附属儿童医院  杭州，310003
摘要：
目的：越来越多的研究显示遗传因素在孤独症发病中起主要作用，并认为突触发育障碍可能参与孤独症的病理发生机制，因此突触相关基因成为孤独症的候选基因。其中轴突蛋白基因Neurexin1（NRXN1）被认为可能与孤独症相关，但目前尚未见有关NRXN1基因单核苷酸多态性与中国汉族儿童孤独症的相关性报道，因此本研究分析NRXN1基因单核苷酸多态性与中国汉族儿童患孤独症风险的关系，以寻汉族儿童孤独症可能存在的易感基因。
方法：利用生物信息数据库，选择NRXN1基因6个标签SNP（rs1363032、rs1421589、rs1563018、rs1851013、rs1520439和rs6712423）作为分子标记，运用基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱方法对229例孤独症儿童和191例无精神神经疾病的正常对照儿童进行SNP基因分型，进行单个SNP和单倍型的病例-对照相关分析。
结果：单个SNP及单倍型分析一致显示NRXN1基因中的一个内含子SNP rs1421589与女性孤独症存在关联，其等位基因频率在女性孤独症和正常对照组之间存在显著性差异（P=0.038），T等位基因可以增加女性患孤独症的危险（OR=1.955，95% CI：1.035-3.69），且在显性和加性遗传模式下，其基因型分布也与女性孤独症存在显著性相关（显性模式：P=0.024，OR：2.86，95%CI：1.12-7.33；超显性模式：P=0.023，OR：2.28，95%CI：1.09-4.74）。单倍型相关分析显示包含该SNP位点危险等位基因的单倍型T-T（rs1421589-rs1563018）可以增加女性患孤独症的危险（P=0.039，OR=1.925，95%CI：1.029-3.604）。
结论： NRXN1基因一个常见变异可能与女性孤独症存在相关性，提示NRXN1基因可能是中国汉族儿童孤独症的易感基因。
关键词：孤独症；轴突蛋白基因；Neurexin1（NRXN1）；单核苷酸多态性
轴突蛋白NRXN1基因单核苷酸多态性与汉族儿童孤独症的关联
余金丹、姚丹、何雪、赵正言
浙江大学医学院附属儿童医院  杭州，310003
孤独症（Autism）是一种广泛发育障碍性疾病，以社会交往障碍、语言发育障碍、兴趣范围狭窄和刻板重复的行为方式为基本特征[1]，临床表现和严重程度不一，迄今发病机制尚不明确，但研究显示遗传因素在孤独症的发病中起主要作用，具有遗传异质性，并且提出神经生物学假说参与孤独症的病理发病机制，认为孤独症为神经发育障碍性疾病[2]，而突触发育障碍是其中一个重要组成部分，推测突触结构异常或功能失衡会造成脑功能紊乱，导致孤独症发生。因此近十年来突触相关基因，特别是NRXNs-NLGNs-SHANK3通路和孤独症相关性的研究成为新的热点[3, 4]，其中轴突蛋白NRXNs（Neurexins）基因家族成员NRXN1被认为是孤独症的功能候选基因。
已有多个研究发现在孤独症患者中存在包含NRXN1基因的染体异常和NRXN1基因异常，因此认为NRXN1基因可能与孤独症有关。同时Szatmari 等[5] 通过家系传递不平衡关联分析NRXN1基因的基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）进行，发现其中两个SNP 位点（rs1363036和rs930752）在孤独症中有过度传递现象（p＜0.05），因此认为NRXN1基因单核苷酸多态性与孤独症有关联。但目前尚未见有关NRXN1基因单核苷酸
多态性与中国汉族儿童孤独症发生的相关性报道，因此本研究选取轴突蛋白NRXN1基因作为候选基因，以标签SNPs作为分子标记，采用病例对照方法分析探讨NRXN1基因单核苷酸多态性与中国汉族儿童患孤独症风险的关系，以寻汉族儿童孤独症可能存在的易感基因。
1. 材料和方法：
1.1研究对象  孤独症病例组229例，为来本院门诊就诊的孤独症患者和部分孤独症培训中心的孤独症患者，平均年龄5.5岁，其中男性191例，女性38例，孤独症诊断标准按照国际疾病分类（ICD-10）和精神疾病诊断和统计手册（DSM-IV）。正常对照组191例，为来我院门诊体检的无遗传性疾病、无神经精神性疾病的正常儿童，平均年龄3.2岁，其中男性142例，女性49例。
1.2 实验方法
1.2.1 标本采集：采集每一研究对象外周血2.0ml注入EDTA抗凝管，轻轻震荡混匀后于4℃冰箱隔夜静置。
1.2.2 基因组DNA的提取：采用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒抽提样本基因组DNA，并
于-80℃保存备用。
1.2.3 SNPs位点的选择和基因分型：利用生物信息数据库（bi.v/snp/），使用SNPbrowser软件以pair-wise r2法来选取标签SNP（参数：r2≥0.8；最小等位基因频率MAF≥5%），再从中选取最优的6个SNPs位点作为分子标记。
1.2.4 基因分型：运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）方法进行基因分型。根据待测SNPs位点及相关序列，设计相关多重PCR引物和SNP引物。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.5 统计学分析：应用拟和优度χ2检验SNP的Hardy-Weinberg遗传平衡（HWE），采用Haploview 4.2软件进行等位基因频率与孤独症的相关分析，采用在线软件SNPstats分析在五种不同的遗传模式下（共显性、显性、隐性、超显性、加性）基因型分布与孤独症的相关性，分别计算比值比（Odds Ratio, OR）及95%可信区间（Confidence Intervals, 95%CIs）。
配对SNPs间的连锁不平衡（LD）程度用参数D’和r2表示，并确定单倍型域及分析不同单倍型与孤独症的相关性，再按性别分组进行相关分析。统计分析显著性差异的P值水平为<0.05。
2. 结果：
2.1 Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验
  在6个标签SNPs中，SNP位点rs6712423基因型频率分布偏离HWE（P<0.05），在后续分析中我们将这个位点排除在外。其余5个SNPs位点基因型分布均符合HWE，且均属于多态位点（MAF>0.05），故进入下一步的分析。
2.2  SNP等位基因频率的病例-对照关联分析
    上述符合HWE的5个SNPs其等位基因频率在孤独症组和正常对照组间不存在统计学显著性差异（P >0.05），再进一步按性别分组进行相关分析，结果显示rs1421589等位基因频率在孤独症组和正常对照组间存在显著性差异（P=0.038），其T等位基因可以增加女性患孤独症的危险（OR=1.955，95%CI：1.035-3.69），而其与男性孤独症不存在相关性，且未发现
其余4个SNPs与不同性别孤独症存在相关性。结果见表1.1。
表1.1 NRXN1基因SNPs位点等位基因频率病例-对照关联分析
SNP
Allele
Total samples(N=420)
Male samples (N=333)
Female samples (N=333)
Control
(%)
Cases
(%)
P
OR(95%CI)
Control
(%)
Case
(%)
P
OR (95%CI)
Control
(%)
Case
(%)
P
OR (95%CI)
rs1363032
(A/G)
A
270
(71.1%)
324
(71.1%)
1.0
1
(0.741-1.35)
204
(72.3%)
271
(70.9%)
0.693
0.934
(0.663-1.314)
66
(67.3%)
53
(71.6%)
0.548
1.224
(0.633-2.364)
rs1421589
(C/T)
T
118
(31.1%)
136
(30.5%)
0.862
0.974
(0.724-1.31)
90
(31.7%)
103
(27.7%)
0.265
0.825
(0.589-1.157)
28
(29.2%)
33
(44.6%)
0.038
1.955
(1.035-3.69)
rs1563018
(T/C)
T
280
(73.7%)
337
(73.9%)
0.943
1.011
(0.742-1.378)
201
(71.3%)
274
(72.1%)
0.815
1.042
(0.74-1.466)
79
(80.6%)
63
(82.9%)
0.700
1.166
(0.535-2.541)
rs1851013
(A/G)
A
290
(77.1%)
361
(80.6%)
0.226
1.231
(0.88-1.7216)
209
(75.2%)
299
(80.1%)
0.134
1.329
(0.916-1.93)
81
(82.7%)
63
(82.9%)
0.967
1.017
(0.460-2.249)
rs1520439
(A/G)
A
141
(37.3%)
190
(41.5%)
0.218
1.192
(0.901-1.576)
101
(36.1%)
155
(40.6%)
0.24
1.21
(0.88-1.663)
40
(40.8%)
基因多态性
35
(46.1%)
0.489
1.238
(0.676-2.266)
2.3 SNP基因型分布的病例-对照关联分析

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