进行性肌营养不良产前基因诊断研究
进行性肌营养不良产前基因诊断研究
DMD致病基因位于Xp21，由于临床病症、实验室检查、肌电图及骨骼肌租化染病理表现相似，需要借助免疫组织化学染、Western印记、聚合链酶反响或基因测序，在蛋白或基因水平上进一步分型诊断。近10年来运用分子生物学技术完成了该病的基因定位、cDNA 克隆、外显子全序列测定等关键工作。现就DMD型疾病产前主要基因检测手段及策略进行介绍。
1 DMD是最常见的遗传疾病
在河北工程大学附属医院儿科遗传咨询门诊就诊的申请产前诊断的患者中，DMD最常见占60%，准确提供这种遗传病的诊断，可解决目前临床实践中大局部相关疾病的诊断问题。
DMD系X-连锁隐性遗传病，是由抗肌萎缩蛋白〔dystrophin〕基因〔也称DMD基因〕突变所致的肌源性损伤。贝氏进行性肌营养不良〔Becker muscular dystrophy，BMD〕也由DMD基因突变所致，发病较DMD晚，而且12最后之后还能行走。白种人中DMD发病率为1/3500活产男婴，约2.5%的女性携带者因不行的“菜昂化〞而得病，但病症比男性轻。所谓“菜昂化〞是指X
DMD致病基因位于Xp21，由于临床病症、实验室检查、肌电图及骨骼肌租化染病理表现相似，需要借助免疫组织化学染、Western印记、聚合链酶反响或基因测序，在蛋白或基因水平上进一步分型诊断。近10年来运用分子生物学技术完成了该病的基因定位、cDNA 克隆、外显子全序列测定等关键工作。现就DMD型疾病产前主要基因检测手段及策略进行介绍。
1 DMD是最常见的遗传疾病
在河北工程大学附属医院儿科遗传咨询门诊就诊的申请产前诊断的患者中，DMD最常见占60%，准确提供这种遗传病的诊断，可解决目前临床实践中大局部相关疾病的诊断问题。
DMD系X-连锁隐性遗传病，是由抗肌萎缩蛋白〔dystrophin〕基因〔也称DMD基因〕突变所致的肌源性损伤。贝氏进行性肌营养不良〔Becker muscular dystrophy，BMD〕也由DMD基因突变所致，发病较DMD晚，而且12最后之后还能行走。白种人中DMD发病率为1/3500活产男婴，约2.5%的女性携带者因不行的“菜昂化〞而得病，但病症比男性轻。所谓“菜昂化〞是指X
染体灭活现象，人类女性两条X染体中随机有一条在胚胎期发生失活。如果女性杂合子正常基因所在的X染体灭活导致细胞功能异常，那么为“不幸的莱昂化〞。一旦“不幸的莱昂化〞细胞占优势，个体就会患病。由于其组织中还有一些细胞是正常的(缺陷基因所在x染体失活)，因此相对于男性患者而言病症要轻。
DMD基因编码的抗肌萎缩蛋白与其他肌浆蛋白形成复合体，与膜蛋白一起形成细胞骨架，并与细胞外蛋白结构连接。复合体中其他蛋白组分缺陷也可导致复合体功能异常，引起类似DMD的肌肉疾病如肢带型肌营养不良(1imb-girdle dys-trophy，LGD)，且多为常染体隐性遗传，易与不典型DMD(尤其是BMD)混淆，应注意鉴别诊断。
2 基因结构特点
DMD基因位于Xp21，基因组DNA片段长约2.3 Mb，由79个外显子组成，cDNA长约14 kb。在DMD基因内存在许多重复序列，形成许多断裂和交换热点，导致基因缺失／重复及容易发生新生突变。
3 基因突变的特点
DMD基因突变的主要类型是基因片段缺失，在基因5’端和3’端分别存在一个缺失高发区，尤其后者，以外显子51区域为顶峰，中国人病例近80％的缺失突变发生在此区域【5】。其中
DMD基因编码的抗肌萎缩蛋白与其他肌浆蛋白形成复合体，与膜蛋白一起形成细胞骨架，并与细胞外蛋白结构连接。复合体中其他蛋白组分缺陷也可导致复合体功能异常，引起类似DMD的肌肉疾病如肢带型肌营养不良(1imb-girdle dys-trophy，LGD)，且多为常染体隐性遗传，易与不典型DMD(尤其是BMD)混淆，应注意鉴别诊断。
2 基因结构特点
DMD基因位于Xp21，基因组DNA片段长约2.3 Mb，由79个外显子组成，cDNA长约14 kb。在DMD基因内存在许多重复序列，形成许多断裂和交换热点，导致基因缺失／重复及容易发生新生突变。
3 基因突变的特点
DMD基因突变的主要类型是基因片段缺失，在基因5’端和3’端分别存在一个缺失高发区，尤其后者，以外显子51区域为顶峰，中国人病例近80％的缺失突变发生在此区域【5】。其中
大范围(一个或数个外显子)缺失型占60％，重复型突变占6％，还有缺失区域不连续或同一患者既有缺失又有重复的复杂突变。通过序列分析显示，微小缺失占3％，单核苷酸改变占29％
4 基因突变检测
联合应用各种基因突变检测技术可对绝大局部病例进行致病突变鉴定。对于不能鉴定出突变
的个体，应考虑其临床诊断是否准确。
4.1 基因缺失/重复突变检测
Southern印迹法是检测基因缺失的经典方法，而PCR(polymerase chain reaction)技术的应用使缺失突变检测变得更简便。最初采用多重外显子PCR扩增检测DMD缺失突变，后来又创立了各种定量检测基因片段的方法，如定量一PCR(quantitative-PCR，Q-PCR)、多重可扩增探针杂交(multiplex amplifi-able probe hybridization，MAPH)、多重连接依赖式探针扩增(Multiplex ligation-dependentprobes assay，MLPA)技术等，可对DMD基因79个外显子进行分析，不仅可检测基因缺失还可检测基因重复。联合应用各种DNA分析手段，对于DMD致病突变基因综合检测能力可达98％，可直接确诊DMD患者，并且将来有可能取代创伤性肌肉活检的病理诊断；而对BMD病例的检测能力仅60％，尚需进一步研究，局部BMD病例可能属
4 基因突变检测
联合应用各种基因突变检测技术可对绝大局部病例进行致病突变鉴定。对于不能鉴定出突变
的个体，应考虑其临床诊断是否准确。
4.1 基因缺失/重复突变检测
Southern印迹法是检测基因缺失的经典方法，而PCR(polymerase chain reaction)技术的应用使缺失突变检测变得更简便。最初采用多重外显子PCR扩增检测DMD缺失突变，后来又创立了各种定量检测基因片段的方法，如定量一PCR(quantitative-PCR，Q-PCR)、多重可扩增探针杂交(multiplex amplifi-able probe hybridization，MAPH)、多重连接依赖式探针扩增(Multiplex ligation-dependentprobes assay，MLPA)技术等，可对DMD基因79个外显子进行分析，不仅可检测基因缺失还可检测基因重复。联合应用各种DNA分析手段，对于DMD致病突变基因综合检测能力可达98％，可直接确诊DMD患者，并且将来有可能取代创伤性肌肉活检的病理诊断；而对BMD病例的检测能力仅60％，尚需进一步研究，局部BMD病例可能属
于抗肌萎缩蛋白复合体中其他蛋白的异常。
4.2 点突变的检测策略
对于非缺失／重复型DMD突变，可应用DHPLC或高分辨溶解曲线分析(high resolution melting curve assay，HRM)逐个检测基因外显子，筛查出突变所在的扩增片段后通过PCR产物直接测序确定突变细节。但仅靠基因组DNA分析不能检测到深埋在基因内含子中或基因调控序列中的致病突变，而用外周血提取mRNA后经逆转录(reverse transcription，RT)一PCR进行突变分析那么可大大减少工作量。如出现扩增片段数目和长度改变，可直接判断基因缺失／重复及影响剪切的突变，而对未发生改变的其他患者，可逐个对RT—PCR片段进行突变筛查和测序
5 遗传咨询中应提供的信息
5.1 新生突变与生殖腺嵌合
DMD病例中，新生突变多见，这是DMD的另外一个特点，表现为散发性、无家族史。严格的新生突变是指在减数分裂过程中出现过失，再次发生可能性不高。但DMD基因中存在高度重复结构，决定了该基因不仅在减数分裂过程中易发生过失，在有丝分裂过程中也可发生过失；不仅在两条X染体间发生，在一条X染体内也可发生。因此，临床分析中男、女性都
4.2 点突变的检测策略
对于非缺失／重复型DMD突变，可应用DHPLC或高分辨溶解曲线分析(high resolution melting curve assay，HRM)逐个检测基因外显子，筛查出突变所在的扩增片段后通过PCR产物直接测序确定突变细节。但仅靠基因组DNA分析不能检测到深埋在基因内含子中或基因调控序列中的致病突变，而用外周血提取mRNA后经逆转录(reverse transcription，RT)一PCR进行突变分析那么可大大减少工作量。如出现扩增片段数目和长度改变，可直接判断基因缺失／重复及影响剪切的突变，而对未发生改变的其他患者，可逐个对RT—PCR片段进行突变筛查和测序
5 遗传咨询中应提供的信息
5.1 新生突变与生殖腺嵌合
DMD病例中，新生突变多见，这是DMD的另外一个特点，表现为散发性、无家族史。严格的新生突变是指在减数分裂过程中出现过失，再次发生可能性不高。但DMD基因中存在高度重复结构，决定了该基因不仅在减数分裂过程中易发生过失，在有丝分裂过程中也可发生过失；不仅在两条X染体间发生，在一条X染体内也可发生。因此，临床分析中男、女性都
可发生。即使缺失型患儿母亲的外周血分析结果显示为多态性杂合(不缺失)，也不能排除生殖腺嵌合。当母亲基因为生殖腺嵌合时再次生育DMD病例的风险高，因此在临床实践中对散发病例再次妊娠都应进行产前诊断。当突变基因标记为外祖父来源时，患者的姨表亲也可能是携带者。
5.2 杂合子(携带者)检测
在X连锁隐性遗传病中，女性携带者生育男性患儿风险为50％，如能确定女性携带者身份，在其首次妊娠时就可提供产前诊断。此文作者曾应用DMD基因两端和内部缺失高发区域的多态性串联重复序列(short tan-dem repeats，STR)E17]结合外显子扩增创立的“一步到位〞法，在检测缺失型基因中80％病例，并可同时准确进行携带者检测。对重复性突变和先证者已故的病例，可用MLPA进行基因剂量分析以检测缺失／重复突变型携带者。 5.3 产前诊断的时机和前提
由于基因突变情况复杂，产前诊断前要进行先证者预分析，以确定其基因突变细节及父母基因多态性标记是否提供了杂合状态的信息，以确定在该家系中实行产前诊断的途径和策略。
产前诊断有2个时间窗口：首选10～12孕周采集绒毛；次选为15～18孕周采集羊水。选择绒毛进行产前诊断的理由有3条：(1)防止母源污染：DMD以缺失型突变为主，母源污染将导致
5.2 杂合子(携带者)检测
在X连锁隐性遗传病中，女性携带者生育男性患儿风险为50％，如能确定女性携带者身份，在其首次妊娠时就可提供产前诊断。此文作者曾应用DMD基因两端和内部缺失高发区域的多态性串联重复序列(short tan-dem repeats，STR)E17]结合外显子扩增创立的“一步到位〞法，在检测缺失型基因中80％病例，并可同时准确进行携带者检测。对重复性突变和先证者已故的病例，可用MLPA进行基因剂量分析以检测缺失／重复突变型携带者。 5.3 产前诊断的时机和前提
由于基因突变情况复杂，产前诊断前要进行先证者预分析，以确定其基因突变细节及父母基因多态性标记是否提供了杂合状态的信息，以确定在该家系中实行产前诊断的途径和策略。
产前诊断有2个时间窗口：首选10～12孕周采集绒毛；次选为15～18孕周采集羊水。选择绒毛进行产前诊断的理由有3条：(1)防止母源污染：DMD以缺失型突变为主，母源污染将导致
诊断错误，发生血性羊水时假设不经培养那么直接导致诊断错误，而绒毛那么可通过形态检查准确挑选。2)早期诊断：如胎儿受累，处理比拟方便(夫妇的知情选择)，而且万一取材失败或分析中出现问题，还可在稍后时间取羊水；采集羊水在孕中期，万一发生血性污染那么需进行羊水培养，盘旋余地太小，重新取样时间上比拟困难。(3)成功率高：绒毛提取的DNA质好量多，成功率高。
6 产前诊断的策略
产前诊断时，首先应进行家系成员21号染体上STR标记的分析。该项检测具备的优点：一是检测21三体综合征，因为在二次生育时孕妇年龄普遍偏大，生育21三体综合征患儿的风险大为提高；二是判断是否有母源污染及污染程度，有时会出现“胎儿材料〞完全是母源的情况；三是核对所分析的DNA材料是否存在混乱。后两点是导致产前诊断过失的主要原因。DMD的产前诊断，首先需确定胎儿性别。如胎儿为男性，那么应针对先证者的基因突变或多态性标记进行分析，确定胎儿是否获得突变等位基因；如为女性，那么可停止基因诊断，因为女性杂合子通常不患病。
对于缺失型基因突变的产前诊断，母源污染是导致诊断错误的重要根源。对胎儿绒毛组织要精心挑选，以去除可能的母源物质，当羊水有血性污染时要进行细胞培养。
6 产前诊断的策略
产前诊断时，首先应进行家系成员21号染体上STR标记的分析。该项检测具备的优点：一是检测21三体综合征，因为在二次生育时孕妇年龄普遍偏大，生育21三体综合征患儿的风险大为提高；二是判断是否有母源污染及污染程度，有时会出现“胎儿材料〞完全是母源的情况；三是核对所分析的DNA材料是否存在混乱。后两点是导致产前诊断过失的主要原因。DMD的产前诊断，首先需确定胎儿性别。如胎儿为男性，那么应针对先证者的基因突变或多态性标记进行分析，确定胎儿是否获得突变等位基因；如为女性，那么可停止基因诊断，因为女性杂合子通常不患病。
对于缺失型基因突变的产前诊断，母源污染是导致诊断错误的重要根源。对胎儿绒毛组织要精心挑选，以去除可能的母源物质，当羊水有血性污染时要进行细胞培养。
为保证产前诊断的准确性，应同时采用直接检测基因突变(缺失检测)与多态性连锁分析两套分析途径，当多态性标记出现额外等位基因时那么提示母源污染的可能。通过基因拷贝数定量分析也可确定胎儿微弱的阳性信号是否为污染所致。胎儿无基因缺失(不受累)时有扩增信号，剂量接近于1，而母源污染所致的扩增信号较弱，其剂量不会到达1。
参考文献：
【1】 汪江,沈定国,刘红.两步-多重PCR诊断134例假肥大型进行性肌营养不良症基因缺失[J]. 中华神经科杂志,1997,(5).
【2】 靳廷丽,唐珉,冯微,等.孕妇外周血中胎儿有核红细胞在杜氏进行性肌营养不良胎儿产前诊断中的应用[J].江西医学院学报,2021,(2).
【3】 蔡竖平,王忠孝,沈定国,等.进行性肌营养不良症基因诊断及家系分析[J].中华内科杂志,2000,(8).
【4】 曹兴国,蔡莉进,李丽,殷国庆.进行性肌营养不良误诊断为病毒性肝炎的分析[J].临床和实验医学杂志,2006,(5).
【5】 宋惠霄,张葆青,刁娟娟.早期诊断进行性肌营养不良1例分析[J].中国误诊学杂志,2007,(7).
参考文献：
【1】 汪江,沈定国,刘红.两步-多重PCR诊断134例假肥大型进行性肌营养不良症基因缺失[J]. 中华神经科杂志,1997,(5).
【2】 靳廷丽,唐珉,冯微,等.孕妇外周血中胎儿有核红细胞在杜氏进行性肌营养不良胎儿产前诊断中的应用[J].江西医学院学报,2021,(2).
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【6】 黄尚志.杜(氏)进行性肌营养不良和脊髓性肌萎缩的基因诊断和产前诊断[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2021,(4).
【7】 杨渝,张成,邱伟,钟月桂.毛细管电泳多重PCR诊断杜氏/贝氏进行性肌营养不良[J].中国优生与遗传杂志,2005,(2).
【8】 袁军辉,胡静. 进行性肌营养不良的分子生物学诊断现状[J].中华医学杂志,2007,(41).
【9】 熊艳,王仁礼. 进行性肌营养不良症携带者基因诊断的研究[J].国外医学(方案生育分册),1999,(2).
[10] 贺静,朱宝生,唐新华,李利,郑淑芳,陈红,苏洁,章印红,李秀玲.假肥大型进行性肌营养不良120例疑诊患者的基因诊断[J]. 实用儿科临床杂志,2021,(8).
[11] 王讳,邱维勤,余龙. X-连锁进行性肌营养不良症(附Becker型肌营养不良一家系基因诊断)[J]. 河北医科大学学报,2001,(6).
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[10] 贺静,朱宝生,唐新华,李利,郑淑芳,陈红,苏洁,章印红,李秀玲.假肥大型进行性肌营养不良120例疑诊患者的基因诊断[J]. 实用儿科临床杂志,2021,(8).
[11] 王讳,邱维勤,余龙. X-连锁进行性肌营养不良症(附Becker型肌营养不良一家系基因诊断)[J]. 河北医科大学学报,2001,(6).
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