论
著
（临床研究）
PD⁃L 1基因多态性对接受卡培他滨辅助化疗结直肠癌
患者的生存期影响
张
宇，王
敏，侯艳华，张俊杰
［摘要］目的
程序性死亡配体1（PD⁃L1）在结直肠癌（CRC ）细胞的免疫逃逸过程中发挥关键作用。文中旨在探讨R0切
除术后CRC 患者接受卡培他滨为基础辅助化疗的无疾病生存期及总生存期的影响。
方法
回顾性分析2010年1月至2017
年12月在郑州人民医院普通外科265例R0切除术后接受卡培他滨为基础辅助化疗的CRC 患者。分析患者基线及接受的预后资料。另收集患者外周血及术后部分癌组织标本分别进行PD⁃L 1基因标记多态性位点的基因分型及PD⁃L 1基因mRNA 的表达测定。分析PD⁃L 1基因多态性位点的基因型和其他变量的相关性。不同基因型患者的PD⁃L 1基因mRNA 表达通过非参检验分析，预后的单变量分析采用Kaplan⁃Meier 生存分析方法，并通过Cox 模型对其他变量进行校正。
结果
纳入研
究的265例患者均可评价疗效，整体人的中位无疾病生存期（mDFS ）为4.6年，中位总生存期（mOS ）为6.5年。纳入研究的PD⁃L 1多态性位点均经过NCBI 数据库查阅在中国人中突变频率>10%的3个标记多态性位点（901T>C 、⁃1813G>C 和⁃1457T>A ）。其中，在预后分析上仅发现901T>C 位点存在显著的临床意义。PD⁃L 1基因901T>C 位点位于该基因内含子区域，在纳入研究的CRC 患者中的分布频率
为：TT 型185例（69.81%）、TC 型72例（27.17%）、CC 型8例（3.02%），最小等位基因频率为0.17，3种基因型分布频率符合哈迪温伯格平衡（P =0.758）。由于CC 基因型患者相对较少，将TC 和CC 型患者合并，两组基因型患者基线临床资料分布均衡。TT 基因型和TC/CC 基因型患者的mDFS 分别为4.8和3.5年，差异有统计学意义（P =0.001）。2种基因型患者的mOS 分别为6.7和4.7年，差异有统计学意义（P <0.001）。经过Cox 模型校正OS 后，TC/CC 基因型对OS 具有独立的影响意义（OR=1.89，P =0.006）。另外在89例癌组织标本的PD⁃L 1mRNA 表达分析中发现，TC/CC 型患者相对于TT 基因型患者，癌组织中PD⁃L 1的mRNA 表达明显较高，差异有统计学意义（P <0.001）。结论
PD⁃L 1基因901T>C 位点可能通过介导PD⁃L 1基
因mRNA 的表达影响接受卡培他滨为基础辅助化疗的CRC 患者预后。
［关键词］结直肠癌；程序性死亡配体1；多态性；预后［中图分类号］R735.3
［文献标志码］A
［文章编号］1008-8199
（2019）04-0391-06［DOI ］10.16571/jki.1008-8199.2019.04.011
Influence of PD⁃L 1gene polymorphism on the survival of colorectal cancer patients undergoing capecitabine -based adjuvant chemotherapy
ZHANG Yu 1，WANG Min 1，HOU Yan⁃hua 2，ZHANG Jun⁃jie 1
（1.Department of Third General Surgery ，People ′s Hospital of Zhengzhou ，Zhengzhou 450003，Henan ，China ；2.Department of Anesthesiology ，the People´s Hospital of Henan Province ，Zhengzhou 450000，Henan ，China ）
［Abstract ］Objective
Programmed death⁃ligand 1（PD -L1）is essential in the immune escape of colorectal cancer （CRC ）
cells.In this study ，we investigated the disease -free survival （DFS ）
and overall survival （OS ）of CRC patients receiving capecitabine -based adjuvant chemotherapy after RO resection.
Methods
This
retrospective study included 265CRC patients treated by RO resec⁃tion and postoperative capecitabine -based adjuvant chemotherapy in Zhengzhou People ′s Hospital between January 1，2010and Decem⁃
基金项目：郑州市科技发展计划项目（20150079）作者单位：450003郑州，郑州人民医院普外三科[张
基因多态性宇
（医学硕士）、王
敏、张俊杰]；450000郑州，河
南省人民医院麻醉科(侯艳华)
通信作者：张俊杰，E-mail ：zhangyucmu@163
ber12，2017.We analyzed the clinical data，performed genotyping of the genetic variants and determi
ned the expression of PD⁃L1 mRNA in the CRC tissue.We also analyzed the correlation between the genetic polymorphisms and other baseline characteristics by chi-square test，the expression of PD-L1mRNA in different genotypes by non-parametric test，and the prognosis using the Kaplan-Mei⁃er method，followed by multivariate Cox regression analysis for adjustment.Results The median DFS and OS of the265CRC pa⁃tients were4.6and6.5years，respectively.Three single nucleotide polymorphisms of the PD⁃L1gene，901T>C，⁃1813G>C and⁃1457T>A，were identified in the NCBI database with the minor allele frequency>10%in the Chinese population，of which，only901T >C was of clinical significance in the outcome analysis.901T>C was located in the intron region of the PD⁃L1gene，with the genotypes of TT in185cases（69.81%），TC in72（27.17%）and CC in8（3.02%）.The minor allele frequency was0.17and the distribution fre⁃quencies of all the three genotypes conformed to the Hardy⁃Weinberg equilibrium（P=0.758）.The median DFS was significantly lon⁃ger in the CRC patients with the TT genotype than in those with the TC or CC genotype（4.8vs3.5years，P=0.001），and so was the median OS（6.7vs4.7years，P<0.001）.The adjustment of OS by multivariate Cox regression analysis showed that the TC and CC genotypes were an independent factor for OS（OR=1.89，P=0.006）.The analysis of89of the CRC tissue specimens revealed a mark⁃edly higher expression of PD⁃L1mRNA in the patients with the TC or CC genotype than in those with the TT genotype（P<0.001）. Conclusion The901T>C polymorphism of the PD⁃L1g
ene may influence the clinical outcomes of the CRC patients receiving capecitabine-based adjuvant chemotherapy by mediating the expression of PD⁃L1mRNA.
［Key words］colorectal cancer；programmed death⁃ligand1；polymorphism；prognosis
0引言
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在我国每年新
发病例约为37.5万，死亡病例约为19.1万［1］。西妥昔
单抗显著降低CRC患者进展风险［2］。贝伐珠单抗和
瑞戈非尼为患者带来生存获益［3］。Pembrolizumab为
微卫星高度不稳定（MSI⁃H）的患者带来新的选
择［4］。Ⅲ期结肠癌推荐3个月的化疗时长［5］。卡培他
滨的辅助化疗方案降低了CRC患者的术后复发风
险［6］。免疫领域的程序性死亡配体1（Pro⁃grammed death⁃ligand1，PD⁃L1）是近年来最热门的基因，也是免疫药物的重要的生物标志物之一［7⁃8］。
该基因编码的蛋白主要表达在肿瘤细胞表面通过和
激活的T细胞表面的PD⁃1结合后，抑制T细胞活性，
引起T细胞凋亡，从而实现肿瘤细胞的免疫逃逸［9］。PD⁃L1的表达和患者预后关系目前结论尚不统一［10］。
PD⁃L1基因位于染体9p24.1，包含8个外显
子。PD⁃L1的表达具有个体差异［11］。先前的研究结
果提示，在肝癌患者中PD⁃L1基因的多态性位点和
肝癌的易感性和预后均显著相关［12］。然而，目前在
辅助化疗方面缺乏PD⁃L1基因遗传变异和预后的关
联研究。因此，本研究旨在评估PD⁃L1基因901T>C
位点对接受卡培他滨为基础辅助化疗的CRC患者
的无疾病生存期（disease free survival，DFS）和总生
存期（overall survival，OS）的影响。
1资料与方法
1.1研究对象回顾性分析2010年1月至2017年12月郑州人民医院普外科行手术切除的CRC 患者。纳入标准：①年龄18~80岁，东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分0~2分，心功能正常（左心室射血分数>50%），肾功能正常（肌酐≤1.5ULN），骨髓功能正常（中性粒细胞计数≥1.5×109/L，血小板计数≥100×109/L，血红蛋白≥9g/dL）；②病理诊断为CRC，且接受手术切除；③预期寿命≥3个月；④接受卡培他滨为基础辅助化疗；⑤有辅助化疗前外周血标本可供检测PD⁃L1基因遗传变异。排除标准：①患有家族性腺瘤性息肉病；②患有其他遗传性CRC综合征。本组最终纳入研究患者265例。本研究得到医院伦理委员会的批准（伦理批号：ZZRMYY⁃100025⁃3）。
接受卡培他滨为基础的辅助化疗，具体用法用量为术后3~4周，卡培他滨1000~1250mg/m2，2次/ d，第1~14天，每21天为1个周期。奥沙利铂，80~ 130mg/m2，静脉滴注，第1天。辅助化疗结合患者情况6~8个周期。根据过程中出现的血液学或非血液学毒性调整相应的给药剂量，发生可能威胁生命的毒性反应时中止。
1.2血液样本收集DNA提取及基因分型每位入组研究的患者在接受辅助化疗前收集外周血样本4 mL，用苯酚氯仿法提取基因组DNA，之后于-20℃
保存。对于PD⁃L1基因多态性分析，本研究纳入了经过NCBI数据库查阅在中国人中突变频率>10%的3个标记多态性位点（901T>C、⁃1813G>C和⁃1457T>A）。设计901T>C（rs2297136）位点的上下游PCR引物，对该位点及附近的DNA片段进行扩增，
上游引物为：5′⁃GCTCCCTGTTTGACTCCATC⁃3′，下游引物为：5′⁃TTTTTCCCCAGACCACTTCC⁃3′，产物片段为274bp，用TaqI内切酶通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR⁃RFLP）方法对该位点进行基因分型。通过条带大小判断该位点的基因型：TT型1条274bp条带；TC型3条条带：1条274bp条带、1条105bp条带、1条169bp条带；CC型2条条带：1条105bp条带、1条169bp条带。部分样本的分型结果通过直接测序的方法进行验证。
1.3组织样本收集及PD⁃L1基因mRNA表达分析纳入研究的部分患者在手术过程中收集被切除的CRC癌组织标本，最终纳入89例癌组织标本，液氮保存。之后用Trizol试剂进行RNA提取，采用上海罗氏real⁃time PCR仪器进行PD⁃L1基因mRNA 表达实验，PD⁃L1基因的上游引物为：5′⁃CTTCCC⁃GAGGCTCCGCACCA⁃3′，下游引物为：5′⁃GCCCC⁃GATGAACCCCTAAAC⁃3′。实时定量
PCR反应体系如下：SYBN Premix Ex Tag溶液10μL，PD⁃L1基因上游引物（20μmol/L）0.2μL，PD⁃L1基因下游引物（20μmol/L）0.2μL，dd H2O7.6μL，cDNA2μL，反应体系总计20μL，GAPDH mRNA表达用作内参。PD⁃L1基因mRNA用相对定量法2⁃△△Ct进行计算。
1.4统计学分析采用SPSS19.0进行分析。χ2检验分析多态性位点基因分型是否符合哈迪温伯格平衡。在基线临床资料当中，离散型的变量和901T>C位点不同基因型的分布采用χ2检验或Fish⁃er精确检验。连续型的变量和901T>C位点不同基因型的分析采用非参的Mann⁃Whitney U检验。
通过Stata绘制Kaplan⁃Meier曲线比较不同基因型患者DFS和OS的差异，组间差异采用对数秩检验进行比较。DFS的计算设为从手术开始到患者出现疾病复发或任何原因出现的死亡或最后一次随访结束；OS的计算设为手术开始到患者因各种原因出现的死亡日期或最后一次随访结束日期。多变量分析时，为进一步校正其他混杂因素的影响，采用Cox风险比例模型，将可能影响OS的风险因素如年龄、性
别、ECOG评分、病理分期以及901T>C位点纳入该模型，用后退法筛选和校正潜在的混杂变量。以P≤0.05为有统计学意义。
2结果
2.1入组患者基线临床资料901T>C、⁃1813G>C 和⁃1457T>A3个位点中，仅901T>C位点在分析中发现了
显著的临床意义。后期分析主要针对901T>C 位点开展。901T>C位点的基因分型结果显示，TT 型185例（69.81%）、TC型72例（27.17%）、CC型8例（
3.02%），最小等位基因频率为0.17，3种基因型分布频率符合哈迪温伯格平衡（P=0.758）。后期分析中将TC和CC基因型患者合并。该位点不同基因型患者在基线临床资料中的分布基本均衡。见表1。
2.2PD⁃L1基因901T>C位点对预后的影响本组患者随访0.6~7.5年，中位随访时间为5.45年。纳入研究的265例患者均可评价疗效，整体人的中位DFS为4.6年（95% CI：
3.83~5.35），中位OS为6.5年（95%CI：5.74~7.27）。
将TC和CC基因型患者合并后，共计80例。单因素分析结果显示，野生型TT基因型患者和TC/CC 基因型患者中位DFS分别为4.8和3.5年，差异有统计学意义（P=0.001）。见图1。2种基因型患者的中位OS分别为6.7和4.7年，差异有统计学意义（P< 0.001），见图2。经多变量校正901T>C位点对OS独立的影响仍均有统计学意义（OR=1.89，P=0.006）。Cox分析结果显示，年龄（OR=1.42，P=0.025）、ECOG评分（OR=2.21，P=0.005）和病理分期（OR= 2.98，P<0.001）
为独立影响因素。
图1PD⁃L1基因901T>C位点不同基因型CRC患者的无疾病生存期曲线对比
Figure1Disease-free survival of the colorectal cancer pa⁃tients with different901T>C genotypes of the
PD-L1gene
2.3
PD⁃L 1基因901T>C 位点对mRNA 表达的影响
89例癌组织标本的901T>C 位点基因分型结果
显示，TT 型62例、TC 型23例、CC 型4例，3种基因型
分布频率同样符合哈迪温伯格平衡（P =0.338）。另外，89例患者的外周血标本和癌组织标本的901T>C 位点基因分型结果的吻合率为100%。CC 型患者相对较少，同样将TC 型和CC 型患者合并，共计27例。901T>C 位点不同基因型患者的PD⁃L 1基因mRNA 表
达见图3。相对于TT 基因型患者，TC/CC 型患者癌组织中PD ⁃L 1基因mRNA 表达水平明显较高（4.08±
1.11vs 2.63±1.78），差异有统计学意义（P <0.001）。
表1
265例CRC 患者的基线临床资料及901T>C 位点基因型分布比较
Table 1
Baseline characteristics and 901T>C genotypes of the 265patients with colorectal cancer
基线资料
年龄[中位数（极值）]性别[n （%）]男女
东部肿瘤协作组评分[n （%）]01~2
肿瘤部位[n （%）]结肠癌直肠癌
肿瘤分化[n （%）]较高中等较低无法评价分期[n （%）]II III
错配修复状态[n （%）]错配修复缺失错配修复存在原发肿瘤分级[n （%）]T1~2T3~4
淋巴结转移状态[n （%）]N0N1N2
辅助化疗[n （%）]卡培他滨
卡培他滨+奥沙利铂总体（n =265）49（18~80）
151（56.98）114（43.02）
188（70.94）77（29.06）
162（61.13）103（38.87）
56（21.13）183（69.06）18（6.79）8（3.02）
56（21.13）
209（78.87）16（6.04）
167（63.02）69（25.04）
196（73.96）56（21.13）137（51.70）
72（27.17）
66（24.91）
199（75.09）901T>C 基因型TT （n =185）49（18~78）
105（56.76）80（43.24）
131（70.81）54（29.19）
114（61.62）71（38.38）
39（21.08）128（69.19）
12（6.49）6（3.24）
39（21.08）
146（78.92）11（5.95）
117（63.24）50（27.03）
135（72.97）
39（21.08）96（51.89）50（27.03）
48（25.95）
137（74.05）
TC/CC （n =80）50（21~80）
46（57.50）34（42.50）
57（71.25）23（28.75）
48（60.00）32（40.00）
17（21.25）55（68.75）6（7.50）2（2.50）
17（21.25）63（78.75）
5（6.25）
50（62.50）
19（23.75）61（76.25）
17（21.25）41（51.25）22（27.50）
18（22.50）62（77.50）
P 值
0.6310.911
0.942
0.804
0.966
0.975
0.913
0.577
0.953
0.552
图2
PD⁃L 1基因901T>C 位点不同基因型CRC 患者的总生存期曲线对比
Figure 2
Overall survival of the colorectal cancer patients withdifferent901T>Cgenotypesofthe PD⁃L1
gene
图3PD ⁃L 1基因901T>C 位点不同基因型PD ⁃L 1基因mRNA 表达情况对比
Figure 3
Relative expression of PD -L1mRNA in the colorectal cancer patients with different 901T>C genotypes
3讨论
本研究纳入的265例CRC患者接受卡培他滨为基础辅助化疗的中位DFS为4.6年（95%CI：3.83~
5.35），中位OS为
6.5年（95%CI：5.74~
7.27），总体数值低于NO16968的研究结果［13］。推测原因在于本研究纳入了较多的ECOG评分为2分的患者，NO16968研究中只纳入了ECOG评分为0~1分的患者，且均接受了卡培他滨联合奥沙利铂的化疗方案。
CRC在临床结果和预后上也有较大的个体差异［14］。目前已经有较多可以预测CRC疗效的生物标记物。2018年报道的VEGFR2基因多态性对接受卡培他滨为基础辅助化疗的结果的影响［15］；2017年报道的四氢叶酸转移酶MTHFR多态性对氟尿嘧啶疗效的影响［16］；2016年报道的胸苷酸合成酶TS多态性对结肠癌一线5⁃FU放疗疗效的影响［17］。这些研究结果均提示药物基因组学在CRC 疗效预测方面的价值。
本研究报道了在中国CRC患者接受5⁃FU为基础的辅助化疗方案时，PD⁃L1基因901T>C位点的C 等位基因携带者可能通过影响该基因的表达，从而影响接受5⁃FU为基础辅助化疗的CRC患者预后。首先，本研究中901T>C位点的最小等位基因频率为0.17，这与NCBI数据库中国人中的突变频率一致；另外也与Xie等［12］的研究中901T>C位点的分布频率基本一致。Xie等［12］研究纳入225例肝癌患者和200例健康志愿者，通过对PD⁃L1基因上4个多态性位点进行基因分型。结果发现901T>C位点CC基因型患者和肝癌发生风险显著相关。另外，在该位点和肝癌患者预后分析方面，Xie等［12］研究和本研究结果也基本一致，即901T>C位点较少等位基因携带患者的预后较差。另外，Du等［18］的研究探讨了位于PD⁃L1基因的3′⁃UTR区域的多态性901T>C位点和非小细胞肺癌的易感性的研究。荧光素酶报告实验的结果表明901T>C位点通过扰乱miR⁃296⁃5p、miR⁃138以及PD⁃L1基因mRNA，从而影响了非小细胞肺癌的易感性。Du等［18］研究的901T>C位点的分布频率和本研究存在差异，可能缘于纳入癌种差异。Xie等［12］研究也初步提示有类似趋势；但Du 等［18］的研究并没有继续探讨901T>C位点不同基因型患者的PD⁃L1基因mRNA表达情况。
另一方面，PD⁃L1基因是目前肿瘤免疫领域的热点基因，多项免疫的临床研究结果显示PD⁃L1的表达水平可以预测PD1和PD⁃L1抑制剂的
疗效［19］。然而，在PD⁃L1基因表达水平和接受常规化疗的CRC患者预后的关联上，目前尚存在较大的争议。本研究结果初步表明PD⁃L1基因mRNA高表达的人在接受5⁃FU辅助化疗时具有较差的预后，这和先前Enkhbat等［20］的研究结果一致。他们的研究纳入了116例手术切除的Ⅱ期和Ⅲ期的CRC患者，分析了PD⁃1、PD⁃L1，以及TGF⁃β的表达水平相关性和预后的关系，发现PD⁃L1高表达的人预后较差。然而，另一方面也有很多研究结果发现，PD⁃L1基因编码的蛋白主要表达在肿瘤细胞表面，通过与激活的T细胞表面PD⁃1结合，进而抑制T细胞活性，引起T细胞凋亡；但体内的作用尚存疑问。因此，也有部分临床研究结果表明，PD⁃L1高表达人患者的预后较好［21］。这些结果可能和纳入研究样本的异质性、接受辅助化疗等情况相关，故尚需要进一步的深入探讨。
总之，本研究发现了在中国CRC人当中PD⁃L1基因901T>C位点是一个独立的预后影响因素。本研究也存在一定局限性：首先纳入研究的样本量较少，缺乏大样本中评估该位点的预后指导意义；另外，研究为回顾性分析，存在研究偏倚。今后的研究可能需要从更大的样本中继续探讨，同时也要从PD⁃L1基因蛋白表达层面去分析该基因的蛋白表达和临床结果的关联，从而阐明该位点造成预后差异的根本原因。
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