肺炎克雷伯菌是医院感染常见的条件致病菌。临床肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素及单环β-内酰胺类抗生素敏感性降低，主要原因是产超广谱β-内酰胺酶。A类超广谱β-内酰胺酶(Extend-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)在克雷伯菌、大肠杆菌为代表的肠杆菌科细胞中最为多见，包括TEM型、SHV型、non-TEM、non-SHV型三类，CTX-M-ESBLs是non-TEM、non-SHV型的重要代表。本文对多重耐药的肺炎克雷伯菌临床株KP9941产超广谱β-内酰胺酶的耐药机制进行研究。
材料与方法 
一、材料
(一)菌株
1.测试菌株KP9941是1999年自我院一患者痰标本中分离获得。菌株鉴定采用AP120E(BioMerieux,Marcy L‘Etoile,France)系统。
2.参考菌株ATCC25922，本实验室保存。E.coli J53-2(SHV-1),Wu,S.W.博士惠赠，E.coli J53-2(TEM-4),沈定霞教授惠赠，E.coli J53-2(SHV-3),，王睿教授惠赠。
(二)药敏纸片
奥格门丁(阿莫西林+克拉维酸，AMC，20μg/10μg)，头孢他定(CAZ，30μg)，头孢噻肟(CTX，30μg)，头孢曲松(CRO，30μg)，亚胺培南(IPM，10μg)等为Oxoid公司产品。氨曲南(ATM，30μg)，Bristol-Myers Squibb公司产品。环丙沙星(CIP，5μg)，庆大霉素(Gm,10μg)纸片购自北京药物生物制品检定所。
(三)工具酶与DNA分子量参照物
PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶购自Takara生物工程公司。限制内切酶NheI(G‘CTAGC)购自美国MBI公司。DNA分子量参照物DL-2000购自Takara生物工程公司。
(四)PCR纯化试剂盒：Wizard  PCR Preps DNA Purification System(Promega)
二、方法
(一)琼脂纸片扩散法(Kirby-Bauer,K-B法)药物敏感试验
应用K-B法测定临床菌株KP9941对抗菌药物的敏感性，药敏实验培养基为Mueller-Hinton琼
脂培养基(M-H，OXOID公司)。药敏判定标准遵照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)规定执行。
(二)双纸片协同试验(DDST)
挑取单个新鲜菌落，置于灭菌生理盐水中混匀，用麦氏比浊管比浊至0.5×108，无菌棉签将待测菌液均匀涂布在厚度约为4mm的M-H琼脂上。在平皿中央放置AMC纸片，四周放置四种三代头孢菌素纸片，三代头孢菌素纸片与AMC纸片中心距离约为25mm。温箱35℃孵育16～18小时后读取结果。如果三代头孢菌素纸片邻近AMC纸片侧的抑菌环增大(≥5mm)，视为产ESBLs阳性菌株。
(三)细菌总DNA提取
参照Pitout JDD方法提取细菌总DNA。取2μl提取物作为PCR模板。
(四)PCR扩增
根据GenBank和EMBL公布的blaTEM DNA、blaSHV DNA和blaCTX-M-DNA序列分别设计
合成3对特异性引物 TP1，TP2；SP1，SP2；M1，M2(上海生工生物工程有限公司合成)，分别扩增349bp、1014bp、551bp长的片段。TP1：5‘CAGCGAATTCAGTTCTGCTATGTGG3‘，TP2：5‘ATTGCTGCAGGCATCGTGGT3‘。SP1：5‘CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC3‘，SP2：5‘TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA3‘。M1：5‘CGCTTTGCGATGTGCAG3‘，M2：5‘ACCGCGATATCGTTGGT3‘。3对引物分别经GeneBank B1AST软件进行同源性分析，与GeneBank核酸数据库中非目的序列无同源性。PCR反应体系(50μl)：10×Taq酶缓冲液5μl，引物各100pmol，4×dNTPs 100μmol/L模板NA 2μl，Taq酶2.5U。
PCR扩增blaTEM DNA即预变性94℃ 5分钟。变性94℃ 45秒，复性55℃ 45秒，延伸72℃ 60秒，共30循环。最后，72℃延伸5分钟，PCR扩增blaSHV DNA复性55℃，PCR扩增blaCTX-M-ESBLs复性52℃。PCR产物在1 0%的琼脂糖凝胶上电泳，在波长254nm的紫外灯下检测扩增结果。大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照，E.coli J53-2(TEM-4)和E.coli J53-2(SHV-3)的细菌总DNA分别作为blaTEM DNA、blaSHV DNA的阳性对照。
(五)PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)
PCR产物纯化参照Wizard  PCR Preps DNA Purification System使用说明进行。限制内切酶NheI(G‘ CTAGC)对blaSHV DNA扩增产物1014bp片段进行酶切反应。反应体系20μl：取blaSHV DNA PCR产物10μl,10×RE Buffer Y +/T  ANqo  TM (含BSA)2μl，限制内切酶NheI 1μl(10U/μl),ddH 2基因多态性O7μl 37℃孵育2小时。酶切产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上分析。
E.coli J53-2(SHV-1)及E.coli J53-2(SHV-3)的PCR产物分别作为酶切反应阴性对照和阳性对照。
(六)DNA序列分析：采用ABI PRISM 377型DNA测序仪进行DNA序列分析。四荧光末端标记，双脱氧法测定DNA序列，正向及反向各测一次。
结 果 
一、K-B法检测临床分离株表型发现KP9941对头孢他定中度敏感，对头孢噻肟，头孢曲松，氨曲南，环丙沙星，庆大霉素等耐药，仅对亚胺培南敏感。大肠埃希菌ATCC25922的各抗生素抑菌圈直径均在质控范围内。
二、DDST试验检测临床分离株KP9941发现头孢他定，头孢噻肟，头孢曲松，氨曲南与奥格
门丁纸片协同现象均阳性。
三、PCR扩增blaTEM DNA、blaSHV DNA及blaCTX-M-ESBLs
以TP1、TP2为引物扩增blaTEM β-内酰胺酶基因发现阳性对照株E.coli J53-2(TEM-4)出现349bp长的blaTEM DNA扩增片段，而KP9941菌株及阴性对照株大肠埃希菌ATCC25922未出现扩增条带。以SP1、SP2为引物扩增blaSHV DNA，发现阳性对照株E.coli J53-2(SHV-1)、E.coli J53-2(SHV-3)和KP9941均出现1014bp长的扩增片段，而阴性对照株大肠埃希菌ATCC25922未出现扩增片段。以M1、M2为引物扩增blaCTX-M-ESBLs发现KP9941出现551bp的扩增片段，而阴性对照株E.coli J53-2(TEM-4)和E.coli J53-2(SHV-3)未发现扩增条带。
四、PCR-RFLP检测blaSHV DNA G827A突变(即氨基酸G238S替代)
blaSHV-1 DNA扩增片段1014bp中不含有NheI限制位点，而blaSHV-ESBLs在nt827发生G A突变(G827A即G238S)，产生一个NheI(G‘CTAGC)限制位点，在NheI限制内切酶作用下1014bp片段被切成771bp和243bp，可检测blaSHV-ESBLs G827A的突变。本实验用NheI进
行酶切分析发现阳性对照株E.coli J53-2(SHV-3)酶切后出现771bp和243bp两个片段，阴性对照株E.coli J53-2(SHV-1)及KP9941均未被切开。
五、序列分析：
对KP9941的blaSHV DNA 的PCR扩增片段进行序列分析发现与blaSHV-1 DNA高度同源，第238位氨基酸为甘氨酸，未发生突变，其它blaSHV-ESBLs突变位点如39、69、104、164、205、237、240、244、265、276均未见改变。
对KP9941的blaCTX-M-ESBLs的PCR扩增片段进行序列分析发现该序列中498bp片段与blaCTX-M-1同源性高达98%，共8个核苷酸改变，即A337G，T375C，G411A，T489G，T644G，T671C，T740A，G810C。与blaCTX-M-12同源性高达99%，仅有1个核苷酸改变G810C(附图)。氨基酸序列分析表明KP9941的CTX-M-ESBLs与CTX-M-12的同源性最高，达99%，仅有一个氨基酸改变，即A250P，第250位丙氨酸(A)被苯丙氨酸(P)替代。该CTX-M-ESBLs与CTX-M-3氨基酸序列的同源性是98%，4个核苷酸不同引起2个氨基酸替代即N92S(N，门冬酰胺)，和A250P。与CTX-M-1氨基酸序列的同源性为97%，有4个氨基酸替代即N92S，D117N(D，门冬氨酸)，S143A和A250P。总之，KP9941的blaCTX-M-ESBLs与
CTX-M亚组1(如CTX-M-1，CTX-M-3，CTX-M-12)同源性最高，达97%～99%，属于CTX-M亚组1。与CTX-M亚组2(CTX-M-2，CTX-M-4，Toho-1等CTX-M亚组3(Toho-2，CTX-M-13等)和CTX-M亚组4(CTX-M-8)的同源性在68%～86%之间。
讨 论 
自1983年德国首次报导分离出产ESBLs的克雷伯菌以来，ESBLs目前已发现100多种。国内细菌耐药性监测，上海地区1988～1998年内肺炎克雷伯菌对头孢噻肟和头孢他定耐药的菌株从2%和13%上升为31%和33%。世界发现的产ESBLs的肺炎克雷伯菌以SHV-ESBLs为主，亦有TEM-ESBLs等其它类型。blaSHV-ESBLs是由相应的广谱酶基因blaSHV-1衍生而来，在国外报道的blaSHV-ESBLs中，绝大多数都有G238S位点的突变，该点对扩大β-内酰胺酶的活性区、增加酶与底物的亲和力、降低Km值都有重要意义。本次对一株多重耐药的肺炎克雷伯菌KP9941进行三种ESBLs的研究，未发现存在TEM DNA，发现存在SHV DNA。用PCR-RFLP方法分析KP9941的blaSHV DNA，未发现G238S位点的突变，blaSHV DNA的序列分析发现与blaSHV-1高度一致，并证实238位为甘氨酸。其它blaSHV-ESBLs突变位点如39、69、104、164、205、237和240位均未见改变。SHV-ESBLs目前已发现近30
种，我国曾报道过产SHV-2型ESBLs的聚团肠杆菌。近年来，非TEM、非SHV型ESBLs种类数量不断增加，包括CTX-M、PER，VEB等类型［3，8，13］。与TEM型、SHV型ESBLs不同，这些ESBLs没有相应的广谱酶基础，不是因母酶活性区几个关键氨基酸的突变形成的。CTX-M-ESBLs自九十年代初在欧洲发现以来，产CTX-M-ESBLs已遍及近东、远东、南美及欧洲等地区。主要分布于伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌等肠杆菌科细菌［14、15］。目前CTX-M型ESBLs已发现17种，根据同源性分为四个亚型，CTX-M亚型1-CTX-M亚型4。顾名思义，CTX-M-ESBLs对头孢噻肟(CTX)具有强大的水解活性，对头孢三嗪(CRO)的水解能力亦高，对头孢噻肟(CTX)具有强大的水解活性，对头孢三嗪(CRO)的水解能力亦高，对头孢他定(CAZ)、氨曲南(ATM)的水解能力较差。此次在临床株KP9941中发现一种CTX-M-ESBLs，推测该菌对头孢他定等耐药与此酶有关，表型特点亦符合CTX-M型ESBLs表现。同源性分析发现该CTX-M-ESBLs与blaCTX-M-12的同源性最高，达99%，属于CTX-M亚型1。

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