源基因稳定的整合到生殖细胞中。但是通过精子载体方法得到的转基因动物中嵌合体的比例很高，其具体的机制尚不清楚。
精原干细胞转移方法的建立，使得人们在活体中可以对精原干细胞进行操作。从理论上讲，通过这种方法得到的转基因动物应该是单倍体，且操作简单、效率高。结合单精子受精技术，在子代中的转基因效率在理论上为100%。作为遗传信息的传递载体，成熟的精子在成熟的过程中，通过各种手段最大限度的对其自身的遗传信息进行保护，所以直接对成熟的精子进行转染等操作效率极低，往往是外源DNA附着在精子上进入卵细胞，所以子代中嵌合体很高。
在精子成熟之前，对精原干细胞进行基因转染和筛选，从理论上应该比胚胎干细胞更容易、适用范围更广泛。同时应该指出：目前背景清楚、稳定的胚胎干细胞系仅来自小鼠，相比之下精原干细胞途径更有应用前景。尽管现在还没有通过这一途径建立转基因动物的报道，但是随着一些技术的应用，有理由相信，离实现这一目标已指日可待。如在活体中通过电击可大幅的提高对精原干细胞的转染效率，通过脂质体亦能在离体和活体有效转染。已经证明在体和离体情况下，反转录病毒可以有效感染精原干细胞，感染效率在2%～20%左右。2001年,Nagano等用反转录病毒离体感染供体睾丸细胞，并将其移植入受体小鼠睾丸中，在子代中4.5%为稳定的转基因小鼠[13]。我们也已开展这方面的工作：利用电击和脂质体均可在体内感染小鼠精原干细胞，并可在异体中移植。
5　精原干细胞在其他领域中的运用前景
在医学、物种保护和畜牧领域具有广阔的应用前景，精原干细胞移植技术的建立使得对精原干细胞的操作成为可能，也为不孕症和珍稀动物物种的保存提供了可能。对于一些不孕症患者，接受高计量放疗、化疗的癌症病人往往造成暂时或永久性的不孕症病人的传统对策是冻存精液，但实际上一般不易收集到大量的精液，必须借助于单精子受精等复杂手段。由于精原干细胞也可以长期冷冻保存，因而利用这种方法自然分泌精子不大受时间限制。在接受以前将患者的精原干细胞取出冻存，等康复后再进行自体或近亲移植，这几乎是最合适的方式。利用这一方法还可保存珍稀动物的精原干细胞，并根据需要繁殖这些珍稀动物。另外，利用这一方法还可大量培育、繁殖品种优良的家畜等。
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单核苷酸多态性的研究进展及其应用
包广宇综述　高春芳　孔宪涛审校
(第二军医大学长征医院实验诊断科，上海200003)
  摘要：本文系统地介绍了单核苷酸多态性的理论基础、相关研究和最新进展，为进行这方面的研究提供线索。
关键词:SN P复杂性状；连锁不平衡；体遗传学；关联研究
中图分类号:Q524+.3　文献标识码:A　文章编号:1001-1048(2003)01-0007-04
收稿日期:2002-0007-04
作者简介：包广宇(1968-)，男，博士研究生  人类基因组DN A序列测序和分析工作的完成[1]为人们系统地研究基因功能及相关遗传疾病
提供了有力的依据。最近，对于人类DNA多态性的研究有了很大发展，继限制性片段长度多态性(re-striction fragm ent length po lymo rphism s,RFLP)和微卫星多态性(m icrosatellite poly morphisms)这两种遗传标记之后，出现了单核苷酸多态性(single nucleo tide po lymo rphism s,SNPs)标记。作为第三代遗传标记,SNPs分布广泛、数目多且相对稳定地存在于人类染体上，在遗传性疾病等的研究方面日益受到重视，阐明其意义将有助于了解人类基因的功能，对人类遗传性疾病的病因诊断、和防治必将产生重大影响。
1　SN Ps的特点
1.1　SNPs的理论基础
SNPs是染体DNA序列的某个位点上存在的单个碱基变化，如果在人中的发生频率超过1%，即为SNPs。理论上,SNPs可以为二、三、四等位基因，但实际上人类中一般为二等位基因。由于cDNA也可以反映基因组的突变情况，因此在实际应用时cDNA的单碱基突变也归为SNPs (cSNPs)，但应用cDNA进行SNPs研究时，应考虑到RN A编辑过程中产生偏差的可能。
二等位基因有四种不同类型，包括一种转换C →T(G→A)和三种颠换C→A(G→T)、C→G(G→C)、T→A(A→T)。四种SNP类型在人类中的发生频率不同最常见的为C→T(G→A)，约占三分之二，其他三种类型发生的频率相同[2]，这可能与核苷酸中易发生5-甲基胞嘧啶脱氨基作用有关。因此，在已知的与
人类疾病相关的突变中，富含G+C 的基因SNPs的发生率要高。
1.2　SNPs的数量多、分布广泛
研究表明[3]，两个等位染体上的基因组DNA 单碱基差异的频率为1/1000bp，其中大部分为多态性，其等位基因在人中的发生频率超过1%，相当于每一个体杂合子碱基的平均几率为0.1%。整个基因组中大约有140万个SNPs存在[4]。编码区域核苷酸多样性比其他区域要低4倍，而且大约一半为无义突变[5]。根据SNPs在基因中的位置可分为编码区SNPs(coding region SNP)、基因周边SNP (perig enic SNP)和基因间SNP(intergenic SNP)三类,SNPs在基因组中的分布十分广泛，但不同的区域出现的频率不同，彼此可相差100倍。
1.3　SNPs适于快速、自动化的筛查和基因分型
SNPs是二等位基因，即二态性标记，非此即彼，在基因组筛查中SNP往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，有利于自动化技术的应用。
1.4　SNPs在基因组中相对稳定
尽管基因组DNA序列以每一个体100单碱基的变异速度进行突变，但大多数的SNP来源于物种形成之后、种出现之前，而且由于每一代中每一核苷酸的变异频率极低(10-8)以及碱基变化的随机性，使得
单碱基等位基因十分稳定人类SNPs 大部分(85%)是共有的(但在不同种中发生的频率不同)。因此，人类基因组变异存在于种内而非种之间[6]。
2　SNPs的研究及其应用
SNPs自身的特性决定了它比其他多态性标记更适合于对复杂性状与疾病关系的遗传解剖和基于体的基因识别等方面的研究。
2.1　SNPs与复杂性状
人类大多数表型变异是由遗传因素和非遗传因素(环境因素)的相互作用和自身变异引起的。许多临床疾病都有其遗传因素存在，是由基因组某一范围突变(主要是SNPs)。敏感基因上含有的SNPs 影响某些常见疾病，如肿瘤、心血管疾病、神经疾患、自身免疫病、糖尿病的风险和对药物的敏感性。对孪生、家系的遗传流行病学研究资料表明，在任何环境条件下，遗传因素对疾病的发生有很高的遗传率。如Alzheimer病的发生，其遗传因素占74%。
复杂性状的形成受许多微效加性基因的作用，与疾病相关的单个SNP不能引起疾病，而是一系列易感性主基因上存在的SNPs的共同作用以及环境因素的影响决定某一个体是否患某种疾病。相互作用的主基因可以有几个、几十个甚至几百个，这些基因中可能存在具有不同危险度的等位基因(等位基因异源性)
，不同的基因对不同的个体影响不同(位点异质性)。基因间的相互作用可以是叠加、协同或上位，引起的病理变化是数量性状而非全或无现象，并且临床表现的产生有一定的阈值。
以前对疾病的遗传因素的研究常常是分析单个基因的异常与疾病的关系，这方面通过连锁分析确定突变位点进行位点克隆的策略的应用十分成功。在比较复杂的疾病中，有时也存在单基因缺陷引起的罕见但又极为严重的结果。但是应用连锁分析对更为复杂的疾病进行研究时，由于疾病的迟发、缺少足够的家系以及诊断不严格等因素，会严
重影响研究的准确进行。
2.2　SNPs与体遗传学
体遗传学是研究体间遗传性构成及相互作用的学科，其主要的研究工具为DN A多态性。由于SNPs数量多、分布广泛、相对稳定且易于筛查和基因分型,SNPs在体遗传学研究中的应用，极大地丰富了对体遗传学的认识，结合分子遗传学的研究成果，能更好地了解基因型-表型的关系。
人类SNPs大部分来源于很久以前单个DNA 分子中发生的单碱基修饰。新的等位基因在其产生时就可能被其他一系列多态性位点所包围，形成一组独特的等位基因(单倍体)。在随后的几代中，当周围的染体区域复制时，单倍体可保持不变，新的等位基因和每一相邻的多态性标记之间存在完全连锁不平衡。
由于连锁不平衡的存在，可以用一个多态性标记代替相邻的另一个特殊的多态性等位基因。但是，连锁不平衡并非长期存在，经过连续几代后，由于减数分裂时多态性位点的重组，导致DNA分子中不同位点等位基因重组，连锁不平衡水平会明显降低。同时基因的转换也会影响连锁不平衡的水平。因此，连锁不平衡可随时间推移而消失。而单倍体随机漂移[8]、自然选择[9]等因素可以保持某些特定区域的连锁不平衡水平。
2.3　SNPs与关联研究
如果某一因素可增加发生疾病的危险性，那么在疾病人中该因素的检出频率比正常对照要高，就可以认为该因素与疾病相关，如吸烟与肺癌、Apo E4与Alzheimer病。对于常见的由高频率、低风险等位基因引起的疾病，采用疾病位点等位基因的关联分析比连锁分析更为有效[10]。对疾病进行关联分析，需要能够简便地确定待检因素在年龄、种族相匹配的病人和对照人中的发生频率。患者和对照人的选择是否恰当，直接影响分析结果的准确性。而体中进行的病例-对照研究易导致病人和对照人不相匹配，进行关联分析时最好以家系为基础。
研究疾病的遗传学基础是为了准确地确定哪种基因序列变异导致功能改变，这就需要建立能够在大量相匹配的病人和正常人中检出与复杂性状相关的全部SNPs的方法。进行SNP关联分析需要考虑到大多数复杂疾病构成十分复杂，由多种不同的低风险因素共同引起，没有明显的标记可供检测。另外，针对
每一标记的研究都是独立的，筛选数百万的标记可能会导致大量错误的关联结果而掩盖真正的关联。必须对实验进行严格的实验设计，并采用合理的统计处理[11]。
有效地进行关联分析的方法之一是预先认真选择，严格限制所检测的致病SNPs，应集中于那些从生物功能上定义的候选基因，或通过差异显示到的基因，或通过连锁分析发现的候选基因中的SNPs，被选择的SNPs很可能有功能效应，如非同义cSNP或启动子区SNPs。应用致病等位基因与其周围SNPs的连锁不平衡性提高关联分析的效果。理论上，如果某一SNP与其附近的致病等位基因呈现较强的连锁不平衡性，那么二者应该与疾病表现出相似的关联性。可应用一系列随机SN Ps扫描其周围的DNA序列以发现指示起病效应的关联信号。由于基于连锁不平衡进行的关联分析采用的是一组随机的多态性标记，并依赖于致病位点本身及其邻近的标记具有足够的连锁不平衡性，所以这种方法在隔离人中非常有效。因为隔离人可能起源于同一祖先，体的建立时间和体的大小都是确定的，隔离可以排除混杂体因素。体的建立时间可以提供与疾病相关基因突变形成的界限，而小体也增加了疾病是由某一个体产生的可能性，从而增强了疾病与体中一个特异单倍体的关联。但对于其他体来说，由于连锁不平衡的不可预测性，基于连锁不平衡进行关联研究则比较困难[12,13]，这时可使用周围基因组中的SNPs进行连锁不平衡关联研究[14]。对具有纯合子型致病基因和固有连锁不平衡的疾病人进行严格选择，同时还应考虑到单倍体之间的关系。
关联研究的真正潜力主要依赖于人中自然存在的连锁不平衡性。对小部分染体区域的研究已经证实：
不同遗传背景的SNPs可以引起相关体不同标记的连锁不平衡的明显变化[11,15]。因此，为了更有效地应用连锁不平衡进行关联研究，必须仔细选择具有相同病因起源的人作为研究对象。总之，进行SN Ps关联分析应考虑以下几个方面:¹病例和对照人起源相同，各项指标应有很好的对应关系。º连锁和关联分析结合可能更为有效。»采用一个或很少的标记得到的阴性相关结果并不能排除其周围序列对疾病的风险性。¼与疾病相关的阳性标记未必能确定其周围的致病序列。
3　展望
SNPs的研究是一个全新的十分重要的领域，对其的研究正在不断深入，基于SNPs的相关研究
需要明确备选基因中SNPs 的数量和特性，构建高密度的SN P 图谱。这就要求有大规模筛查和基因分型的SNPs 的工具[16]，包括DNA 测序、DNA chip 、dHPLC 、MA LDI-T OF 等的高通量、自动化技术的逐渐完善[17]，极大地推动了SNPs 的研究。同时，为了避免浪费和减少错误结果，现已建立了SNPs 的相关数据库，提供有关的资料备查询
[18]
dna多态性
。
SNPs 的深入研究，必将为人类遗传学、分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和等方
面的研究产生积极的作用。参考文献
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一种分析大分子结构的新方法——T GGE SYST EM
龙跃洲　李　伟综述
(泰山医学院病理教研室，山东泰安271000)
  摘要:T G GE 即温度梯度凝胶电泳方法是近年发展起来并逐步得到广泛应用的一种分析大分子结构的新方法。它利用T m 值不同的大分子在温度梯度凝胶电泳过程中形成不同空间构象而得以分离，具有操作简易、省时、灵敏、检出率高、假阳性率低等特点。在dsDN A 点突变检测、R NA 二级结构分析、蛋白质结构转换及蛋白分子与核酸分子相互作用的热稳定性分析等方面的应用已日益得到人们的重视。
关键词：温度梯度凝胶电泳；点突变
中图分类号:R394-33　文献标识码:A  文章编号:1001-1048(2003)01-0010-04
收稿日期:2002-05-20
作者简介：龙跃洲(1972-)，男，讲师，硕士
  人类基因组约含3～5万个基因，其中约10%～15%的基因表现出转录为mRNA 的活性，这些核酸(DNA 与RNA)分子及其编码产物(蛋白质分子)是构成生命信息传递链的关键性生物大分子。大量的研究资料表明，人类许多疾病的发生发展都与这些生物大分子的序列发生变异(如肿瘤发生过程中基因出现异常的扩增、重排、缺失或点突变以及蛋白质分子发生氨基酸转换等)有关；而且研究多基因家族不同拷贝之间序列的差异也是深入理解分子进化机制的必要步骤，因此，探索分析生物大分子空间结构的新方法一直都是分子生物学研究的热点。温度梯度凝胶电泳法(tem perature gra-dient g el electro phoresis ,T GGE )是新近发展起来
的一种方法，它引入线性温度梯度这一参数使因发生变异而具有不同熔解温度(melting temper ature ,Tm )的生物大分子在凝胶电泳中因空间构象的改变而得以分离。目前在双链DNA (do uble strand DNA ,dsDNA)点突变的检测方面，与SSCP 方法相比,TGGE 由于检测对象是dsDNA 的碱基改变，对点突变位置无严格限制从而明显提高了阳性检出率；线性温度梯度的引入还解决了SSCP 优化温度条件的困难。T GGE 方法与体外实验相结合，已被应用于模拟研究反义RNA 分子与靶RNA 分子在体内相互作用的情况。而在研究蛋白质分子空间构象及蛋白质分子与核酸分子相互作用方面，与通常的光谱学、流体动力学方法相比,TGGE 方法所需样品量少并可用于研究化学试剂对蛋白质分子构象稳定性的影响。本文将TGGE 方法的基本原理、应用情况和优缺点介绍如下。

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