DNA标记技术
1遗传标记概述
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。遗传标记可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。在作物育种中通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。在现代分子育种研究中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段。
2遗传标记的发展
19世纪后半叶，孟德尔（G.Ｊ. Mendel）以豌豆为材料，发现了生物遗传的分离规律和独立分配规律，即著名的孟德尔定律。1910年以后，摩尔根将孟德尔“遗传因子”的行为与染体的行为结合起来进行研究，证实了“遗传因子”是染体上占有一定位置的实体，由此导致了细胞遗传学的诞生。1941年，美国遗传学家G. W. Beadle和生化学家E. L. Tatum通过研究红面包霉
的生化突变型，对一系列营养缺陷型进行遗传分析，提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。1953年，J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA分子结构的双螺旋模型，宣布了分子遗传学时代的到来。1980年，人类遗传学家D.R.L. Botstein等首先提出了DNA限制性片段长度多态性（RFLP）可以作为遗传标记的思想，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。1985年，DNA多聚酶链式反应(PCR)技术的诞生，使直接体外扩增DNA以检测其多态性成为可能。1990年，J.G.K. Williams等和J. Welsh等两个研究小组应用PCR技术同时发展了一种新的RAPD分子标记。随后，基于PCR技术的新型分子标记不断涌现。
3遗传标记的种类
3．1形态标记
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒或芒毛等的相对差异。典型的形态标记用肉眼即可识别和观察。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如生理特性、生殖特性、抗病虫性等。由自发突变或物理化学诱变均可获得具有特定形态特征的遗传标记材料。
形态标记基因的染体定位最初是通过经典的二点、三点测验进行的。通过判断不同性状间的遗传是否符合独立分配规律，来确定控制这些性状的基因是否连锁。采用这种方法把相互连锁在一起的基因定为一个连锁，并与染体相对应，以性状间重组率作为这些基因在染体上的相对距离，并确定其毗邻关系。1910年，摩尔根领导的实验室根据对果蝇六个形态性状的分析，发现了连锁遗传现象，并根据研究性状与形态标记的连锁关系，构建了生物中第一张遗传连锁图，开创了利用已知染体相对位置的标记基因定位未知基因的先例。
由于形态标记数量少、可鉴别标记基因有限，因而难以建立饱和的遗传图谱。另外，许多形态标记还受环境、生育期等因素的影响，使形态标记在植物育种中的应用受到一些限制。
3．2 细胞学标记
细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染体结构上和数量上的遗传多态性。染体结构特征包括染体的核型和带型。核型特征是指染体的长度、着丝粒位置和随体有无等，由此可以反映染体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异；带型特征是指染体经特殊染显带后，带的颜深浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染体上常染质和异染质的分布差异。
染体数量特征是指细胞中染体数目的多少，染体数量上的遗传多态性包括整倍性和非整倍性的变异，前者如多倍体，后者如缺体、单体、三体、端着丝点染体等非整倍体。
由于染体结构和数量变异常具有相应的形态特征，因此，培育这样的细胞学标记材料，可以在后代中直接对相应的形态标记进行选择，不必进行染体鉴定就可确定其细胞学特征，从而提高细胞学标记的利用效率。细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择。有些物种对染体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料。某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难，从而限制了细胞学标记的应用。
3．3 蛋白质标记
许多生物大分子或生物化合物都具有作为遗传标记的潜力。酚类化合物、黄酮类化合物、花素苷及糖苷类分子曾被用作为分子标记（Mckee 1973）。但由于分离和检测这些分子的技术和手段通常比较复杂，而且费时费钱，使之很难适合于大体的常规检测，因此这类生化物质作为遗传标记是不理想的。与此相反，许多蛋白质分子分析简单快捷，是有用且可靠
的遗传标记。用作遗传标记的蛋白质通常可分为酶蛋白质和非酶蛋白质二种。
蛋白质是基因表达的产物，与形态性状、细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境影响更小，能更好地反映遗传多态性，因此蛋白质标记是一种较好的遗传标记，已被广泛应用于物种起源和进化研究、种质鉴定、分类和抗病性筛选等领域。
但蛋白质标记仍然存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需特殊的显方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；局限于反映基因组编码区的表达信息等。最关键的不足是其标记的数量还比较有限。
3．4 DNA标记
DNA分子标记：是DNA水平上遗传多态性的直接反映。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，哪怕是单个核苷酸的变异。因此，DNA标记在数量上几乎是无限的。与以往的遗传标记相比，DNA标记还有许多特殊的优点，如无表型效应、不受环境限制和影响等。目前，DNA标记已广泛地应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等各个方面。
理想的dna多态性DNA标记应具备以下特点：（1）遗传多态性高；（2）共显性遗传，信息完整；（3）在基因组中大量存在且分布均匀；（4）选择中性；（5）稳定性、重现性好；（6）信息量大，分析效率高；（7）检测手段简单快捷，易于实现自动化；（8）开发成本和使用成本低。目前已发展出十几种DNA标记技术，它们各具特，并为不同的研究目标提供了丰富的技术手段。但还没有一种DNA标记能完全具备上述理想特性。
4 DNA标记技术
4．1基于DNA-DNA杂交的DNA标记
该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显技术来揭示DNA的多态性。其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的RFLP标记。
RFLP即限制性片段长度多态性。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点。因此，限制性内切酶能将很长的DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA分子上限制
性酶切位点的分布。特定的DNA／限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它能作为某一DNA（或含有该DNA的生物）的特有“指纹”，这种“指纹”在DNA分子水平上直接反映了生物的遗传多态性。
4．2基于PCR的DNA标记
根据所用引物的特点，这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。
随机引物PCR标记包括RAPD标记、ISSR标记、AP-PCR标记、DAF标记等，其中RAPD标记使用较为广泛。随机引物PCR所扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究。
RAPD标记引物通常9-10个碱基，短的引物为了提高揭示DNA多态性的能力。由于引物较短，所以在PCR中必须使用较低的退火（DNA复性）温度，以保证引物能与模板DNA结合。RAPD标记的优点是，对DNA需要量极少，对DNA质量要求不高，操作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组。RAPD标记的不足之处是，一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提供的信息量不
完整。另外，由于使用了较短的引物，RAPD标记的PCR易受实验条件的影响，结果的重复性较差。
特异引物PCR标记包括SSR标记、STS标记、SCAR标记、RGA标记等，其中SSR标记已广泛地应用于遗传图谱构建、基因定位等领域。特异引物PCR所扩增的DNA区段是事先已知的明确的，具有特异性。因此特异引物PCR标记技术依赖于对各个物种基因组信息的了解。
SSR的基本重复单元是由几个核苷酸组成的，重复次数一般为10～50。同一类微卫星DNA可分布在基因组的不同位置上。由于基本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性。每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，因此可根据两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的迁移距离，就可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。
4．3基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记
这类DNA标记可分为二种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记。另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS标记。
AFLP标记的基本原理是，通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。首先用两种能产生粘性末端的限制性内切酶将基因组DNA切割成分子量大小不等的限制性片段，然后将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头（adapter）连接，所形成带接头的特异片段用作随后的PCR反应的模板。所用的PCR引物5’端与接头和酶切位点序列互补，3’端在酶切位点后增加1～3个选择性碱基，使得只有一定比例的限制性片段被选择性地扩增，从而保证PCR反应产物可经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分辨。AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。AFLP扩增片段的谱带数取决于采用的内切酶及引物3’端选择碱基的种类、数目和所研究基因组的复杂性。
由于AFLP是限制性酶切与PCR结合的一种技术，因此具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。不足是，需要使用同位素或非同位素标记引物，相对比较费时耗财。
4．4基于单核苷酸多态性的DNA标记
SNP标记是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性。
鉴定SNP标记的主要途径有二条：（1）在DNA测序过程中，利用碱基的峰高和面积的变化
来监测单个核苷酸的改变引起的DNA多态性；（2）通过对已有DNA序列进行分析比较来鉴定SNP标记。不过最直接的方法还是通过设计特异的PCR引物扩增某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的比较，来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记。

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