dna多态性【摘要】    目的 ：评价异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）再生障碍性贫血的临床疗效。方法：3例再障患者，其中重型再障2例，再障-PNH综合征1例，均为HLA全相合亲缘供者。预处理方案：重型再障患者为CTX+ATG方案，再障-PNH综合征患者加用白消安、氟达拉宾，急性移植物抗宿主病（aGVHD）预防方案为环孢菌素A（CsA）加氨甲喋呤（MTX）联合方案，以前列素E1预防肝静脉闭塞病（VOD），以巨细胞病毒（CMV）抗原血症监测和更昔洛韦预防CMV病。结果：3例患者经DNA短串联重复序列多态性分析证明为供髓植入，中性粒细胞大于0.5×109/L的平均天数为16 d（12～20 d），血小板大于20×109/L的平均天数为20 d（15～23 d）。发生Ⅱ度aGVHD 1例，未发生cGVHD，未发生移植排斥。中位随访时间248 d（138～465 d），全部患者均无病生存。结论：allo-HSCT是再生障碍性贫血的有效方法。
【关键词】  贫血 再生障碍性 造血干细胞移植 移植排斥
  再生障碍性贫血(AA)是临床常见的难治性血液病，尤其是重型再生障碍性贫血(SAA)，发病急，病情重，以往病死率极高（＞90%）。异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是SAA的有效手段，其治愈率可达75%～80%[1-2]。由于SAA病情进展极快，HLA相合供者来源缺乏，
在我国，已开展allo-HSCTSAA的单位不多，我们应用allo-HSCT再生障碍性贫血3例，取得较好疗效，现报告如下。
  1  资料和方法
  1.1  一般资料
  我们在2007年11月-2008年11月，共开展allo-HSCT再生障碍性贫血3例，其中SAA 2例，再障-阵发性睡眠性血红蛋白尿（AA-PNH）综合征1例，均为HLA全相合亲缘供者。患者的临床资料和供、受者之间的关系见表1。
  1.2  方法
  1.2.1  供者造血干细胞采集：病例1体重达150 kg，供者为其胞妹，体重为45 kg。为采集足够数量的造血干细胞，采用外周血+骨髓联合移植，采用重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）5μg·kg-1·d-1动员。于动员的第4天在连续硬膜外麻醉下采集骨髓，采集到单个核细胞（MNC）1.21×108/kg，CD34+细胞0.35×106/kg；分别于动员的第5天、第7天用CS3000 血细胞分离机(Baxter公司)采集外周血MNC，采集到MNC 1.68×108/kg，CD34+细胞0.62×1
06/kg，共输入MNC 2.89×108/kg，CD34+细胞0.97×106/kg。病例2、病例3均只采用rhG-CSF动员，采集外周血干细胞（方法同上，见表2）。
  1.2.2  预处理方案：病例1、病例2采用环磷酰胺（CTX）+抗胸腺细胞球蛋白（ATG）（兔抗）方案，CTX 60 mg·kg-1·d-1，-5至-2 d；ATG 5 mg·kg-1·d-1； -5至-2 d。病例3预处理方案为白消安200 mg，-8至-6 d；CTX 3.0，-5至-4 d；氟达拉宾50 mg， -5至-3 d；ATG 100 mg，-5至-1 d，输液量＞4 500 mL/d，碱化尿液及美司钠（总量为CTX剂量的150%）预防出血性膀胱炎。
  1.2.3  急性移植物抗宿主病（aGVHD）预防方案：采用环孢素A(CsA)联合短疗程甲氨蝶呤(MTX)的经典方案。CsA从-1 d开始2.5 mg·kg-1·d-1，微泵持续静脉滴注，胃肠道症状改善后，改为5 mg·kg-1·d-1口服，每周监测1次全血CsA浓度，维持在200～300 ng/mL。MTX用法：+1 d为15 mg/m2，+3、+6、+11 d为10 mg/m2，静脉给药。
  1.2.4  其他并发症预防：患者从移植前9 d开始口服复方新诺明、氟康唑、黄连素进行肠道除菌。采用前列腺素E1（PGE1）预防肝静脉闭塞病（VOD）， PGE1 40μg/d，从移植后0 d到45 d静脉滴注。预防巨细胞病毒（CMV）感染方案：更昔洛韦0.25～0.5 g/d，-8至-1 d，
从0 d开始改用阿昔洛韦0.5 g/d，0至+30 d，每周检测CMV抗原血症，CMV-pp65抗原阳性，对阳性患者以更昔洛韦0.5 g/d预防性，直至CMV抗原血症转阴2周停药。例1用羟乙基淀粉去除供者骨髓红细胞。
  1.2.5  支持：全部患者均住空气层流无菌病房。移植后第6天开始皮下注射rhG-CSF 5μg·kg-1·d-1，至中性粒细胞≥2.0×109/L停用。移植后10 d开始予高糖、脂肪乳剂、复方氨基酸等支持，至患者基本能正常饮食后停用。当患者血小板低于20×109/L时输注单采血小板，血红蛋白低于80 g/L时输注洗涤红细胞，所有血制品输注前均行照光或用过滤器去除白细胞。
  1.2.6  植入证据检测：移植后连续3 d外周血中性粒细胞大于0.5×109/L为植入成功。使用短串重复序列聚合酶链反应(STR-PCR) 行移植后植入鉴定。移植后1、2和3个月行骨髓细胞学、染体及血型检查，以后每3个月行骨髓细胞学检查。
  2  结果
  2.1  造血重建
  移植物有核细胞平均数为3.11(2.10～4.35)×108/kg，CD34+细胞平均数为2.79（0.97～5.60）×106/kg。移植后患者中性粒细胞大于0.5×109/L的平均天数为16 d（12～20 d），血小板大于20×109/L的平均天数为20 d（15～23 d）（见表2）。
  2.2  供髓植入证据
  3例移植患者经DNA短串联重复序列以及染体检测、ABO血型检测均为供髓完全植入。
  2.3  并发症
  病例1移植过程中发生出血性膀胱炎，积极对症后好转。移植后+89 d发生皮肤型II度aGVHD，使用甲基泼尼龙80 mg/d，+96 d好转，未发生慢性GVHD(cGVHD)。移植后+92 d患者出现皮肤疱疹病毒感染，经抗病毒后治愈。移植后半年，患者出现反复副鼻窦炎、上呼吸道感染，经抗感染后好转。病例2移植后+2 d出现发热、腹痛，以下腹部为主，考虑为急性胃肠炎，予抗感染、对症支持后好转，+7 d出现发热、咽痛，考虑上呼吸道感染，予亚胺培南和万古霉素针抗炎后好转。例3移植后+4 d出现中上腹疼痛，考虑为急性胃黏膜损伤，予对症后好转，+11 d出现发热、咳嗽，考虑为上呼吸道感染，予美
洛培南和万古霉素针抗炎后好转。+30 d患者出现低热，偶有咳嗽、无咳痰，胸部CT检查提示：肺部真菌感染，予伏立康唑针200 mg静脉滴注，每日2次，+35 d体温恢复正常，2周后改予伏立康唑片200 mg口服，每日2次，共4周，+55 d复查胸部CT正常。+33 d患者出现腹泻，大便涂片检查可见白细胞，革兰氏染以阳性杆菌为主，考虑为难辨梭状芽孢杆菌性肠炎可能，口服去甲万古霉素，0.2 g，每日4次，+35 d腹泻好转。3例患者均未发生VOD和间质性肺炎。
  2.4  随访
  平均随访时间248 d（138～465 d），全部患者均无病生存。最长患者已无病生存465 d。
  3  讨论
  Allo-HSCT是SAA的有效方法。移植排斥是其存在的主要问题，早期移植排斥的发生率高达30%～60%，预处理方案加入ATG和CTX后，移植排斥的发生率降至5%左右[3]。国内翟卫华等[4]报道，异基因造血干细胞移植16例再生障碍性贫血患者，14例（占87.5%）获得造血重建，移植排斥2例（占12.5%）。本组3例患者均采用CTX+ATG为预处理方案，
其中1例再障-PNH综合征患者加用白消安、氟达拉宾，3例患者均获得完全植入，未发生移植排斥。移植排斥的发生还与移植物造血干细胞数量有关[5]。一般移植中心要求移植物MNC达到（2～3）×108/kg，本组3例患者均达到该标准，病例1体重达150 kg，而供者体重仅45 kg，相差3倍以上，我们采用外周血+骨髓联合移植的方法，采集到足够数量的造血干细胞，保证移植物成功植入。此外，移植排斥的发生还与移植前多次输血、机体处于致敏状态有关。SAA患者病情重，进展迅速，需大量成分输血支持，本组病例1、病例2移植前曾多次输单采血小板、浓缩红细胞，所有血制品均采用照光或过滤的方法去除白细胞，有效减少了机体致敏状态的发生。
aGVHD是Allo-HSCTSAA的主要并发症之一，发生率约在30%～40%，不仅影响生存率，也严重影响患者移植后的生活质量[1]。随机研究表明，联合应用MTX+CSA方案优于单用MTX方案，目前为止，MTX+CSA仍然是AA患者预防GVHD最常用的方案[6]。本组患者均采用MTX+CSA预防GVHD，仅1例患者发生II度aGVHD，经常规剂量激素后好转，未发生cGVHD。另2例患者因随访时间尚短，cGVHD尚有待观察。
  异基因造血干细胞移植是PNH（包括AA-PNH综合征）患者唯一治愈方法[7]。年龄较轻、
严重血细胞减少或反复发生血栓的患者是移植最合适人选。清除PNH克隆可采用清髓或非清髓预处理方案。本组病例3为AA-PNH综合征，病史长达16年，以接触苯后出现视物不清、乏力起病，血常规及骨髓常规检查提示AA，予CSA为主免疫抑制后好转；10年前出现血尿，外周血细胞流式细胞仪检查CD55、CD59缺失，诊断为AA-PNH综合征，移植前2个月，出现腹泻，粒缺，经CSA、G-CSF及抗感染，感染控制，但仍为粒缺，达SAA标准，具有移植指征。为清除PNH克隆，我们在ATG+CTX预处理方案基础上加用白消安、氟达拉宾，患者成功获得供髓植入，外周血细胞流式细胞仪检查未检测到CD55、CD59缺失克隆。
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