实验九染体核型分析
【实验目的】
1. 观察测量照片上每条染体，进行配对排列和剪贴成核型分析图；
2. 掌握染体组型分析的各种数据指标，学习和掌握核型分析的方法；
3. 正确理解生物的遗传多样性——染体多样性。
【实验原理】
核型(Karyotype)亦称染体组型，是指体细胞有丝分裂中期细胞核(或染体组)的表型，是染体数目、大小、形态特征的总和。每一个体细胞含有两组同样的染体，用2n表示。其中与性别直接有关的染体，即性染体，可以不成对。每一个配子带有一组染体，叫做单倍体，用n表示。两性配子结合后，具有两组染体，成为二倍体的体细胞。在对染体进行测量计算的基础上，进行分组、排队、配对，并进行形态分析的过程叫核型分析(如图1所示)。将一个染体组的全部染体逐条按其长短、形态、类型等特征排列起来的图称为核型图，它代表一个物种的核型模式。核型分析通常包括两方面的内容：⑴ 确定一物种的染体数目；⑵ 辨析每条染体的特征。
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图1 人类中期细胞染体核型分析(2n=46)
染体在复制以后，纵向并列的两个染单体，通过着丝粒联结在一起。着丝粒在染体上的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，染体可分成相等或不相等的两臂，造成中部着丝粒(m)，亚中部着丝粒(sm)、亚端部着丝粒(st)和端部着丝粒(t)等形态不同的染体(如图2所示)。此外，有的染体还含有随体或次级缢痕，所有这些染体的特异性构成一个物种的核型。细胞分裂中期是染体的形态结构最典型的时期，通过显微镜摄影，将选取伸展良好，形态清晰，有代表性的细胞分裂相进行高倍拍摄放大，得到用于核型分析的照片。
图2 中期染体形态及结构
1. 分析标准：⑴ 臂比值r(长臂长/短臂长)；⑵ 着丝粒指数i[(短臂长/染体长)×100%](表1)；⑶ 相对长度：某条染体长度占一套单倍体染体长度总
和的百分比：相对长度(%)＝(某染体长度/单套染体组总长)×100％(植物)；或：相对长度(%)＝[某染体长度/(单套常染体+X染体)的总长]×100％(动物)；⑷ 臂比指数(N.F.值)：把具中部和近中部着丝粒的“V”形染体计为2个臂，而把具近端和端部着丝粒的“J”或“I”染体计为1个臂，以此统计核型中总臂数；⑸ 染体长度比：根据染体长度比[(最长染体长/最短染体长)×100%]。
表1：着丝粒位置的确定(Levan 1964年的二点四区系统标准)臂比着丝粒指数着丝粒位置简写
1.00
1.01～1.70 1.71～3.00 3.01～7.00 大于7.01 ∞50.0
50.0～37.5
37.5～25.0
25.0～12.5
12.5～0.0
正中部着丝粒
中部着丝粒
亚中部着丝粒
亚端部着丝粒
端部着丝粒
正端部着丝粒
M
m
sm
st
t
T
2. 核型公式：某种植物核型公式为2n=2x=10=6m+2sm+2st(SAT)，其中x代表染体基数，表明该植物为2倍体，6m代表有6条染体为中部着丝粒，2sm代表有2条染体为亚中部着丝粒，2条染体为亚端部着丝粒并带有随体。
3. 核型分类：Stebbins根据核型中染体的长度比和臂比两项特征，区分核型的对称与不对称程度，将其分为12种类型(表2)。
表2：核型的对称与不对称分类(Stebbins)
最长/最短
臂比大于＞4∶1的染体的百分比
0.0 0.01~0.5 0.51~0.99  1.0
＜2∶1 2∶1～4∶1＞4∶11A
1B
1C
1A
1B
1C
1A
1B
1C
1A染体多态性
1B
1C
注：A为对称核型，B为中间类型，C为较不对称核型。
3. 实践应用：核型分析可以探明生物遗传与变异、染体组演化和种属间亲缘关系等，同时染体显带也表明不同个体及物种的染体显带核型均有化，这种现象称染体多态性(Chromosome Heteromorphism)，因此核型分析在遗传学研究特别是与人类染体疾病的临床诊断方面有着重要的应用。
【实验材料】
制作好的动物或植物染体制片。
【实验准备】
器具：放大镜、直尺、剪刀、镊子、计算器、座标纸、绘图纸、胶水等。【实验步骤】
1. 染体数目统计：观察统计时原则上要观察尽可能多的个体约100个细胞为宜，使其具有较高的准确性和代表性。
2. 准备染体标本的相片：将制备的细胞轮廓清楚，染体集中而不重叠，着丝粒、次缢痕和随体清晰，染体长度适中而不弯曲的，不扭曲、不断裂的5个以上的染体标本，通过显微镜与数码相机或电脑的数据接口，形成并储存成图片格式，最终打印成相片。
3. 染体测量：确定染体数目，目测相片上每条染体长度，按长短顺序初步编号，写在相片上每条染体的背面，用钢尺逐个测量每条染体长度[长臂(q)长、短臂(p)长]，根据相片计算出各条染体的相对长度、臂比值及着丝粒位置，有随体的染体，其随体长度和次缢痕长度可计入全长，也可不计入，但必须加以说明。将测量的数据记录于表1。
表1 核型分析实测记录表
序号(条)
实测长度(mm)序号
(条)
实测长度(mm)
长臂短臂全长长臂短臂全长
1 2 3
5 6 …
4. 染体相关数据的计算：将计算的数据记录于表。
表2 核型分析计算表
序号(对)相对长度(%)臂比着丝粒位置染体类型1
2
3
…
总和
5. 核型图：
5.1 染体排序与分组：⑴按染体由长到短重新编号，由左向右顺序贴在纸上。若两对染体长度完全相等，则按短臂的长度顺序排列，长者在前，短者在后；⑵着丝点排列在同一水平线上，短臂在上，长臂在下；⑶着丝粒类型相同，相对长度相近的分一组；⑷同一组的按染体长短顺序配对排列；⑸各指数相同(包括显带)的染体配为一对；⑹可根据随体的有无进行配对；⑺如有超数染体、性染体，则排在最后；⑻ 如果核型中有差异明显而恒定的杂合染体对时，单独列出并附加说明。
5.2 完成上述步骤的染体剪贴后，再附一张同一照片的中期分裂相，即成为染体核型图。排列好后亦可进行分析比较，确定其核型是否正常。
6. 核型模式图：根据前面的计算结果和排列的核型图，用绘图纸和座标纸(座标纸放在绘图纸下面)绘制核型模式图。横座标为染体序号，纵座标为染体(臂)的相对长度，“0”为长、短臂的分界线，长臂在下，短臂在上。各个染体依横坐标方向按序号排列，染体宽占5小格，相互之间隔点10小格，着丝粒位于纵坐标0处，占4小格，纵坐标为相对长度，次缢痕占1小格，染体臂及随体长度每μm用10小格。
7. 模式照片：将所分析的质量较高的有丝分裂中期染体完整照片粘贴在绘图纸上方正中，照片上注明放大倍数，并在照片上标出一个以1μm为长度单位的标尺，以便目测出染体实际长度，这样能给人以真实感同时也便于他人评定核型分析的准确度。
8. 在核型图和核型模式图的正下方标明核型公式。
【注意事项】
无论何种方法，制片时都可能造成染体的丢失、重叠等现象；制片方法不同，细胞所处的生理状态不同，染体的收缩程度就不同；用秋水仙素等药物进行预处理还能引起染体加倍，所有这些因素都能使我们的观察结果产生偏差。因此不能仅根据对一两个细胞的观察结果确定一个物种的核型，而必须观察、分析多个个体、多个细胞。一般至少要统计30个以上的分散良好、染体形态清晰的有丝分裂中期细胞，如这些细胞的染体都恒定一致，即可认定为该物种的染体数目。
【实验作业】
1. 制作染体核型图，并绘制染体模式图。
2. 简要描述实验所测核型的分析结果。

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