秦巴山区智力低下儿童FRAXF基因多态性研究
【关键词】 儿童
  Study on FRAXF gene polymorphism in children with mental retardation in Qinba　mountain district
  【Abstract】 AIM: To investigate the association between FRAXF gene polymorphism and the child intelligence in Qinba mountain district. METHODS: FRAXF genotype was detected in 84 mental retardation (MR) children and 74 normal controls by using PCR and polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) methods. The association of FRAXF gene polymorphism and the child intelligence was studied. RESULTS: Nineteen alleles had been checked out in MR group with the repeat frequency ranging 728. Twentyone alleles had been checked out in control group， the repeat frequency ranging 120. The distribution of FRAXF genotype was significantly different between MR and control groups(χ2=14.05， P<0.005). CONCLUSION: There was an association between FRAXF gene polymorphism and the child intelligence. FRAXF gene may be one of the candidate genes predisposing to MR.
  【Keywords】 polymorphism (genetics); child; intelligence; FRAXF
  【摘要】　目的： 研究秦巴山区儿童FRAXF位点多态性与儿童智力之间的关系. 方法： 应用多聚酶链式反应（PCR）结合聚丙烯酰胺电泳凝胶分析系统分析技术对84例智力低下儿童及对照组72例智力正常儿童的FRAXF基因多态性进行检测比较，探讨FRAXF基因多态性对儿童智力的影响. 结果： 病例组共检出该位点19个等位基因，重复次数范围为7~28. 对照组共检出该位点21个等位基因，重复次数范围在1~20. 通过χ2检验，两组之间等位基因多态性分布差异显著（χ2=14.05， P<0.005）. 结论： 结果提示FRAXF基因的不稳定性可能与儿童的智力发育有关. FRAXF基因可能是儿童智力低下的易感基因之一.

  【关键词】 多态现象（遗传学）；儿童；智力；FRAXF
　　0引言
  1969年Lubs等首次发现X染体上具有1个脆性位点（FRAXA）［1］，此后遗传学家相继在人类基因组上发现了26个脆性位点，其中3个位于Xq2728区带上（FRAXA， FRAXF及FRAXE）［2-4］. 过去认为除FRAXA和FRAXE之外，其他24个脆性位点只是人类基因组中
染体多态性
正常的多态性位点［5］. FRAXF基因是否可以作为MR的候选基因尚在探讨. 秦巴山区地处秦岭深处，交通不便，地域因素造成了相互较为隔绝的人，平均每个自然村智力低下患者达到7%~8%，是智力低下儿童基因多态性研究的一个特殊体. 本研究通过对这个特殊地区的正常儿童及智力低下儿童FRAXF基因多态性的检测，探讨了FRAXF基因多态性与儿童智力之间的关系.
  1对象和方法
  1.1对象智力低下（mental retardation， MR）组为84(男45，女39)例，均为柞水安康两地经智商测定(采用韦克斯勒儿童智力表法)为MR儿童，年龄0~14岁. 对照组72(男35，女37)例，为同一地区同龄智力正常儿童，年龄0~14岁. MR者与对照组在年龄上进行了匹配，二者无显著性差异. 引物由上海博亚生物技术有限公司合成，Taq DNA 聚合酶购自鼎国公司. PCR扩增试剂盒购自宝生物公司. 测序由上海基康生物公司完成. 采集研究对象的外周静脉血5 mL，加ACD抗凝，保存于-20℃冰箱中，全血经蛋白酶K消化，采用酚/氯仿法抽提基因组DNA.

  1.2方法
  1.2.1基因多态性检测PCR引物序列参照文献（Fu等，1991）. 基因序列从美国生物信息中心NCBI网站上查询. 扩增片段长度为360 bp. 引物序列P1: 5′CTG AGG TTC ATG GCG GAG AAC3′， P2：5′GCT CAC TCC CAG CCT CCA TCC3′.　PCR反应体系：模板DNA 50 mg/L 2 μL，引物50 pmol/3 μL 1.5 μL， 10 mmol dNTP 2.4 μL， Taq酶33.34 μkat/L 1 μL， 10×Buffer (Mg+) 3 μL， H2O 21.6 μL， 总体积30 μL. 扩增反应在PerkinElmer 9600扩增仪中进行. 反应条件：95℃变性 7 min后加Tag酶；94℃变性 2 min，55℃退火1 min， 72℃延伸 2 min，循环30次后，72℃延伸7 min，扩增产物4℃冰箱保存. 通过15 g/L Agrose凝胶电泳观察是否有PCR扩增产物，通过80/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶分析系统分析，确定PCR扩增产物碱基个数，同时随机挑选PCR产物由上海基康技术有限公司测序，进一步确定所扩片段是否准确以及侧翼序列的碱基个数. 多态位点CCG重复次数n＝（PCR扩增产物碱基数量-侧翼序列碱基个数）/3，从而确定CCG的个数. 鉴定基因型.
  统计学处理： 组间基因频率差异用χ2检验. 所用统计软件为SPSS10.0软件包.
　　2结果
  2.1智力低下儿童FRAXF基因多态性检测了84例智力低下儿童外周血标本，72例正常儿童
对照.病例组共检出该位点19个等位基因，片段大小381~444 bp，基因频率在0.8%~13.3%之间，重复次数范围为7~28. 重复次数多为11， 13. 对照组共检出该位点21个等位基因，片段大小360~420 bp，基因频率在1.8%~11.9%之间，重复次数范围为1~20，重复次数多为9次(图1). 两组之间等位基因多态性分布差异显著（χ2=14.05， P<0.005， 表1）.
  2.2智力低下组儿童FRAXF基因多态性性别分布病例组和对照组内男女之间差异无显著性（P>0.05， 表2）.
　
  2.3PCR产物测序确定扩增片段(CCG)重复次数及片段大小(图2).
  表1FRAXF基因多态性在病例组与对照组之间的分布（略）
  表2FRAXF基因在病例组及对照组中男女之间的分布（略）
  图1FRAXF基因多态性在病例组及对照组中的柱形分布图（略）
  图2FRAXF基因多态性的测序图谱（略）
　　3讨论
  1943年Martin首次报道了一个X连锁形式的智力低下家系，以后命名为脆性X综合症. FRAX系X性遗传疾病，是儿童MR的常见原因，在人中发病率男性约1/4000，女性稍低［5］. 其分子学机制是因FMR1基因第1外显子非翻译区CCG重复区异常扩增及异常甲基化，引起FMR1基因而不转录，或转录后翻译效率低，生成编码蛋白脆X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein， FMRP)减少或不能生成FMRP所致［6］. 因为中枢神经系统发育多有FMRI基因的高度表达，若FMR1 mRNA 缺乏可能会损害皮层和边缘系统的发育，影响依赖于皮层和边缘系统功能意志、学习和记忆行为［7］. 现研究表明，除FRAXA基因外，其他FRAX基因尚无足够的证据证明其与MR有关. 提示FRAXF基因多态性与儿童智力有相关性. 该基因（CCG）重复次数大于20时，儿童智力异常的可能性较大.

  本研究是在秦巴山地区这个物殊儿童体进行FRAXF基因多态性的研究，发现FRAXF基因多态性与儿童智力可能有相关性，该位点等位基因分布符合HardyWeinberg平衡遗传定律［8］，具有代表性. 多态信息量（PIC）： 0.86，结果表明该位点具有丰富的多态信息量. 根据绘制的柱形图示，表型正常的人重复次数的峰值为9次，表型表现为MR的人重复次数的峰值为11次、13次. 病例组最低重复次数为7次，对照组最低只有一次重复；当重复达到
20次以上时，病例组仍有7个病例出现，对照组则没有. 病例组最高重复次数高达28次. 通过χ2检验，两组之间等位基因多态性分布差异显著（P<0.005）. 由实验结果可看出，FRAXF位点的重复次数虽不象FRAXA位点和FRAXE位点的那样达到成百上千次，患者与对照之间在多态分布上还是有差异的. 结果提示：FRAXF基因的不稳定性可能与儿童的智力发育有关，FRXAF基因可能是儿童智力低下的易感基因. 在陕西人中，FRAXF位点也存在微卫星多态性现象，其可能是人遗传不稳定的表现之一，也是MR可能造成的原因之一.
  【
参考文献
】
  ［1］ Lubs HA. A marker Xchromosome［J］. Am J Hum Genet， 1969，21:231.
  ［2］ Annemieke JMH， Pieretti M， Sutcliffe JS. et al. Identification of a gene (FMR1) containing a CGG repeat comicdent with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome ［J］. Cell， 1991，65:905-941.
  ［3］ Hirst MC， Barnicoat A， Flynn G， et al. The identification of a third fragile site， FRAXF in Xq2728 distal to both FRAXA and FRAXE ［J］. Hum Mol Genet， 1993，2:197-200.
  ［4］ Knight SJL. Flanncry AV， Hirst MC， et al. Trinuclectide repeat amplifyication and hypermethylation of a CpG idland in FRAXE mental retardation［J］. Cell， 1993，74:127-134.
  ［5］ Turner G， Wake S， Webb T， et al. Prevalence of fragile X syndrome ［J］. Am J Med Genet， 1996，64(1):196-197.
  ［6］ Jin P， Warren ST. Understanding the molecular basis of fragile X syndrome ［J］. Human Mol Genet， 2000，9(6):901-908.

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