克隆山羊乳蛋白多态性分析
庞云龙1，顾迎迎2，张婷2，臧矫2，成勇2*
（1．丹阳市农委，江苏丹阳212300；
2．江苏省高校优势学科优势学科/扬州大学兽医学院，江苏扬州225009）
摘要：对2只来自同一细胞系的克隆山羊和3只无亲缘关系的白山羊应用限制性片段多态性（ＲFLP）和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）进行基因型和乳蛋白电泳图谱进行分析比较。研究结果显示：2只克隆羊基因指纹图谱完全相同，相同遗传背景的克隆山羊产后羊乳中乳蛋白组分存在差异，其中C50克隆羊酪蛋白含量和种类明显高于同一克隆的C4克隆山羊；1#、2#、3#正常白山羊基因指纹图谱分析相互不存在亲缘关系，3只正常白山羊产后第15天、第20天、第25天、第30天和150天奶样品乳蛋白电泳图谱不存在明显差异。结果提示：山羊乳蛋白多态性不仅与遗传多态性有关，而且可能与非染体遗传或表观遗传相关。这一结果有助于乳蛋白遗传多态性研究，也可能为高产奶山羊培育提出新的思路。
关键词：山羊；SDS－PAGE；乳蛋白；多态性；基因型
中图分类号：S827文献标志码：B文章编号：0529－5130（2014）12－0040－04
现代家畜育种工作要求技术人员及时、有效、准确地发现并选择符合品种生产方向、具有较高生产性能的优秀动物个体。蛋白质电泳技术的发展为动物育种和繁殖问题提供了蛋白表型的有效检测工具。通过电泳分离出蛋白质多态性，作为遗传标记，以多态性与一些经济性状和生物学性状的相关为依据，进行早期选种［1］。国内外科研人员对此进行了深入研究，其中部分结果已应用于动物育种实践中［2］。对乳中蛋白质多态性的研究始于1964年，Aschaffenburg用淀粉凝胶电泳发现黑白花奶牛牛乳中β－乳球蛋白具有多态性［1］。然后，科研人员又检出了牛乳中其他五种主要蛋白质组分（αs－1酪蛋白、αs－2酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白和α－乳白蛋白）的多态性［2－4］。进一步研究表明，牛奶中蛋白质多态性与牛的生产、繁殖、抗病能力等性状和乳制品品质特性等方面都存在着不同程度的相关［2－5］。但是，国内外乳蛋白多态性与基因型的相关性研究较少有报道［6］，而克隆山羊羊奶的乳蛋白多态性及与基因型的相关性比较研究尚未见报道。本研究旨在利用聚丙酰胺凝胶电泳，分析奶山羊羊乳中蛋白质的多态性，探索乳蛋白、乳清蛋白的遗传多态性与产奶量、乳成分之间的相关关系，为乳成分指标的早期选择和乳中蛋白质特性对乳制品品质的影响等提供理论依据。
收稿日期：2014－02－17
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08008－004）；江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD）
作者简介：庞云龙（1957－），男，高级兽医师，从事乳品研究
*通信作者：成勇，教授，主要从事动物转基因和体细胞克隆研究，E-mail：chengyong@yzu.edu 1材料与方法
1.1试验动物
关东奶山羊与波尔山羊杂交F1代母羊腺上皮细胞作为供核体细胞获得的体细胞克隆山羊，雌性，年龄3岁，体重30 40kg。与关东奶山羊公羊配种，并正常泌乳。常规繁殖关东奶山羊与波尔山羊杂交母羊，雌性，年龄3 4岁，体重35 45kg。试验羊由干苜蓿草喂养，饮用自来水。
染体多态性
1.2试验仪器
全套水平和垂直平板电泳仪设备；GIS3000凝胶图像分析系统；DNA扩增仪（HB－PX－MAN，英国HYBAID）；离心机（GTL－16A，江苏南达生物技术公司）刻度吸管、锥形瓶、移液等；Mini－PＲO-TEANⅡ蛋白电泳仪（美国，BIO－ＲAD）。
1.3试剂及其配制
主要试剂（若无特别说明皆为国产分析纯级）。细胞裂解液（100mL）：10mL1mol/L Tris－HCl （pH8.5）+2mL200mmol/L EDTA+1mL20%SDS +4mL5mol/L NaCl+83mL ddH
2
O；PCＲ引物：针对山羊MHCⅡDＲB基因第二外显子设计3条引物：DＲB1.1：5'－TAT CCC GTC TCT GCA GCA CAT TTC－3'；Gio：5'－CGT ACC CAG AGT GAG TGA AGT ATC－3'；DBＲ1.2：5'－TCG CCG CTG CAC ACT GAA ACT CTC－3'，由上海博亚生物技术有限公司合成。
1.4山羊羊乳的采集和处理
定期收集山羊乳样品，－20ħ冷冻保存；奶山羊全乳以8000g、4ħ、20min离心除去上层乳脂，获得脱脂乳，脱脂乳用1.0mol/L的HCl调至pH 4.6，然后以10000g、4ħ离心30min，取上清液用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
1.5克隆羊亲子鉴定
除对新生克隆羊与正常白山羊做毛、花纹和性别比较外，应用扩增片段长度多态性（AFLP）技术对克隆羊进行基因型鉴定［6－7］。提取克隆羊和对照白山羊耳组织基因组DNA，以此为模板，进行PCＲ扩增。PCＲ程序为：第一轮用引物DＲB1.1和Gio，94ħ预变性5min后，加入Taq酶（热启动），再以94ħ变性1min，60ħ退火2min，72ħ延伸2min，进行10个循环；然后向反应物中加入另一对引物，DＲB1.1（10μmol/L）和DＲB1.2（10μmol/L）各1.5μL，再用以下程序：94ħ变性1min，65ħ退火30s，72ħ延伸30s，进行30个循环。反应产物用ＲsaⅠ酶切，酶切产物电泳15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用凝胶成像系统分析电泳条带。
1.6克隆山羊与普通山羊乳蛋白SDS－PAGE分析
30%丙烯酰胺/N，N'－亚甲双丙烯酰胺（含29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N，N'－亚甲双丙烯酰胺）和10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）配制成凝胶液，用TEMED（N，N，N’，N'－四甲基乙二胺）及10%过硫酸铵为催化剂，制备12%分离胶和5%的浓缩胶；2ˑSDS加样缓冲液（100mmol/ L Tris－HCl（pH6.8）、200mmol/L DTT（二硫苏糖醇）、10%巯基乙醇、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油）；5ˑ电泳缓冲液（3.0mol/L Tris，pH至8.8、10%甘氨酸、10%电泳级SDS）；染液：90mL甲醇ʒ水为1ʒ1（w/v）与10mL冰醋酸混合液中加入0.25g考马斯亮蓝Ｒ250，用Whatman1号滤纸过滤后室温保存；脱液（30%甲醇、10%冰醋酸、60%双氧水）。
脱脂乳蛋白组分分析参照Lammili（1970）SDS －PAGE方法［8－9］，在含巯基乙醇的还原条件下进行电泳，考马斯亮蓝Ｒ250染，并用凝胶成像系统对染后的蛋白条带区域进行扫描和相对含量分析。
2结果
2.1克隆羊与普通白山羊性别、毛、外貌表型分析
从2只克隆羊与3只普通白山羊表型（性别、毛、外貌）（表1）可见，来自同一体细胞系的克隆山羊
具有相同的毛、花斑和角的特性，性别也与供体细胞完全一致，来自普通白山羊的个体角的性状有差异。
2.2克隆羊与普通羊基因型分析比较
应用PCＲ－ＲFLP法鉴定，结果两只供核山羊所呈现的带型完全相同，再克隆山羊间的带型完全相同，并与供核山羊的带型相同，与受体羊带型不同，见图1。结果表明，体细胞克隆山羊C50、C4与供核山羊基因型相同，具有相同的遗传背景，而正常白山羊1#、2#、3#电泳条带各不相同，与克隆羊也完全不同，表明正常白山羊的遗传背景相互不一致。
表1克隆羊与正常白山羊表型对照
编号性别细胞系毛角年龄
C－50♀GMEC7#白底黑斑无角38个月
C－4♀GMEC7#白底黑斑无角38个月
1#♀白有角约3岁
2#♀白无角约3.5岁
3#♀白有角约2.5
岁
1．克隆羊C50；2．克隆羊C4；3．提供体细胞的羊；4－6．正常白山羊1#－3#；M．DNA分子量
图1克隆羊PCＲ－ＲFLP亲子鉴定电泳
2.3克隆羊与普通羊乳蛋白组分电泳
乳蛋白组分图谱见图2－图4。图2显示产后第1天的乳中，克隆羊C－50在29ku左右的酪蛋白出现4个不同分子量的条带，而包括C－4克隆羊在内的其他普通白山羊仅1个条带，这从图谱上比较差异明显；图3显示：克隆羊C－50产后第1天乳与C－4产后第2天和产后第120天乳比较，可见在29ku附近均出现多个条带，但克隆羊C－50的条带数量及酪蛋白含量均明显较其他羊高，同时，其中α－酪蛋白含量各个羊乳中基本一致，但在35ku附近的β－酪蛋白含量C－50羊乳中明显偏高；图4显示产后15、20、25、30d的克隆羊和普通白山羊乳蛋白电泳图谱，除克隆羊C－50第30天呈现酪蛋白的多个条带外，其他克隆羊及其他时间点的乳的蛋白图谱基本一致。
1．正常2#白山羊；2．蛋白Marker ；3．克隆羊C －50；4．克隆羊C －4；5．正常白山羊1#；6．正常白山羊2#；7．正常白山羊3#
图2产后或流产后第1天的克隆羊和
正常白山羊电泳
1，7－10．羊3#，3#，2#，1#，3#；2．蛋白Marker ；3．C －50克隆羊（产后第2天奶）；4．C －4（120日龄流产奶）；5．2#羊（产后第2天奶）；6．人乳；上样均为50μg /5μL
图3相同遗传背景的克隆羊及不同遗传背景的
白山羊乳蛋白组分电泳
条带从左向右依次为：克隆奶山羊羊奶样品1．C50－1（产后15d ）；2．C50－2（产后20d ）；3．C50－3（产后25d ）；4．C50－4（产后30d ）；5．蛋白分子量（ku ）；6．正常白山羊2#羊奶（产后15d ）；7．正常白山羊2#羊奶（产后20d ）；8．正常白山羊2#羊奶（产后25d ）；正常白山羊2#羊奶（产后30d ）
图4产后15 30d 克隆羊与正常白
山羊乳蛋白电泳
3讨论
相同遗传背景的克隆羊虽然其年龄、性别、毛和亲子鉴定DNA 指纹图谱都完全一致，但电泳图谱有明显差异；而不同遗传背景及年龄等其他表型差异较大的正常白山羊，其乳蛋白电泳图谱却存在完全一致的情况。C50与C4克隆羊同相是产后第1天乳，图2显示C50乳中酪蛋白含量及种类明显高于C4，并且有多量的β－酪蛋白，而C4的电泳图谱与3只正常白山羊完全一致。这一结果提示染体遗传背景
完全一致的不同个体其乳蛋白成份及相应各组份及含量并不一定完全一致，这一结果目前尚无类似报道。从理论上分析，这种情况可能与非染体遗传有关。由于C50与C4克隆羊来自同一株山羊乳腺上皮细胞，其亲子鉴定的结果也证明来自同一个体的体细胞，从理论上来判断存在染体遗传完全一致性，
但用于制备克隆羊的卵母细胞来自不同个体，因此，非染体遗传是不一致的，提示乳蛋白多态性不仅与染体遗传有关，而且与非染体遗传有关。本试验中大部分正常白山羊乳蛋白图谱差异不明显。但根据报道，不同个体以及不同泌乳期的乳蛋白存在多态性，这一结果可以说明本研究中克隆羊乳蛋白图谱存在差
异性是有实验依据的
［10－11］
。同时，试验表明用克隆动物研究乳蛋白多态性对家畜育种具有科学价值。
参考文献：
［1］
Aschaffenburg Ｒ．Protein phenotyping by direct polyacrylamide-gel electrophoresis of whole milk ［J ］．Biochimica et Biophysica Acta （BBA ）－General Subjects ，1964，82（13）：188－191．
［2］罗军，李建文，刘祝奎．山羊乳蛋白多态性与产奶性能的关系研究［
J ］．西北农业大学学报，1994，22（1）：12－16．［3］巨智勇．国外有关牛乳蛋白的研究［J ］．国外家畜学－草食家畜，1988，（1）：30－33．
［4］
Zulloa A ，Baronea C M A ，Chianeseb L ，et al．Protein polymor-phisms and coagulation properties of Cilentana goat milk ［J ］．Small Ｒuminant Ｒesearch ，2005，58：223－230．
［5］
Pazzola M ，Dettori M L ，Pira E ，et al．Effect of polymorphisms at the casein gene cluster on milk renneting properties of the Sarda goat ，Small Ｒuminant Ｒesearch ［J ］．2014，journal home page ：w
w w．elsevier．com /locate /smallrumres
［6］
Yuan Y G ，Cheng Y ，Guo L ，et al．Cloned kids derived from cap-rine mammary gland epithelial cells ［J ］．Theriogenology ，2009，72：500－505．
［7］袁玉国，成勇，郭磊，等．以经过转染的乳腺上皮细胞生产克隆羊［
J ］．生物工程学报，2009，25：1138－1143．［8］董得宽．电泳法在畜牧兽医科技中的若干应用［J ］．国外家畜学－草食家畜，1987，（1）：41－45．
苹果渣代替麸皮饲喂肉鸭效果试验
康永刚，廖云琼
（徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州221006）
摘要：选用60只樱桃谷鸭，随机分为4组，每组5只，设3个重复，每个重复5只，试验日粮分别用风干未发酵苹果渣粉（试验组II），半干发酵苹果渣粉（试验组III），膜发酵苹果渣粉（试验组IV）各5%替代基础日粮中5%的麸皮，试验期为6周，对照组（I）为基础日粮组，麸皮含量为5%。结果显示，6周龄平均体重及日增重II组略低于I组（P＞0.05），III和IV组都显著高于I和II组（P＜0.05）；饲料转化率II、III、IV 组高于I组，分别提高了1.4%，7.6%和19.36%。III、IV组高于II组，分别提高了6.12%和17.72%，其中，膜发酵处理的效果（试验组IV）较好。结果表明，膜发酵苹果渣对肉鸭生长发育有显著的促进效果。
关键词：苹果渣；肉鸭；生长性能
中图分类号：S816.4文献标志码：B文章编号：0529－5130（2014）12－0043－02
我国是世界上最大的苹果生产国，年产苹果约3300万t，占世界总产量的40%以上，苹果加工成苹果汁后副产品近400万t，而且加工数量逐年上升，苹果渣的总产量十分可观。由于苹果和果汁的生产季节集中，果渣绝大部分作为工业垃圾被丢弃，造成了资源浪费和环境污染［1］。
苹果渣中果皮果肉占96.2%，果籽占3.1%，果梗占0.7%，营养成分全面而丰富。苹果渣的粗蛋白含量较低，而粗脂肪和无氮浸出物则含量较高，干渣的代谢能值（牛）接近于玉米（10.668MJ/kg）和麸皮（9.534MJ/kg），鲜渣和青贮的代谢能值接近于玉米青贮（2.478MJ/kg）。此外，含有较丰富的磷、钾、铁、锰、硫等多种矿物质元素和维生素。由苹果渣的成分可以看出，完全可以通过科学手段使苹果渣成为畜禽的有益饲料［2－3］。据牛竹叶等［4］研究，添加半干发酵苹果渣粉组和膜发酵苹果渣粉试鸡平均体重及日增重显著高于喂基础日粮的对照组和风干未发酵苹果渣粉组，喂基础日粮的对照组略高于风干未发酵苹果渣粉组，表明发酵苹果渣粉对雏鸡生长发育有显著的促进效果；李龙等［5］研究，添加不同浓度的苹果渣对产蛋量影响不大，对蛋鸡平均蛋重的影响有所不同，但其平均蛋重均有所提高。
目前，国内外关于苹果渣对肉鸭的影响尚无报道，本试验用苹果渣代替肉鸭饲粮中的麸皮，观察其饲喂效果，旨在开拓苹果渣的利用途径，发展节粮型养殖业，以提高苹果产业和畜牧业经济效益。
1材料与方法
1.1基础日粮
选用徐州正昌饲料有限公司生产的配合饲料为基础日粮，其麸皮含量为5%，主要营养水平为ME 12.30MJ/kg，CP18.1%。
1.2试验日粮
分别用风干未发酵苹果渣粉，半干发酵苹果渣粉，膜发酵苹果渣粉各5%替代基础日粮中5%的麸皮，组成3种试验日粮。基础日粮组为对照组（I），试验日粮组分别为II、III、IV试验组，苹果渣的成分含量见表1。
表1苹果渣成分含量%水分粗蛋白粗脂肪粗纤维粗灰分钙总磷77.0ʃ5.3  6.2ʃ0.6  6.2ʃ0.816.9ʃ2.7  2.3ʃ0.50.06ʃ0.020.06ʃ0.02
收稿日期：2013－11－11
作者简介：康永刚（1980－），男，讲师，硕士1.3试验动物及设计处理
试验鸭选自广西桂柳家禽公司沛县分公司，
櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔
共选
［9］张才骏．生物学标记在育种中的应用［J］．国外畜牧学－草食家畜，1985，（3）：36－39．
［10］张才骏．牛β－乳球蛋白多态性及其在家畜育种中的应用［J］．国外畜牧业－草食家畜，1987，（3）：3－4．［11］Meirelles F V，Bressan F F，Smith L C，et al．Cytoplasmaticin heri-tance，epigenetics and reprogramming DNA as tools in animal breed-
ing［J］．Livestock Science，2014，166：199－205．

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。