南京农业大学学报2021,44(1) ：103-110
Journal  of  Nanjing  Agricultural  University http : / /n auxb  .njau. edu . cn DO1 ：10.7685/jnau.202004037
李婷，朱文姣，陈敏，等.茄子SmNTF3基因的克隆及其表达模式分析[J].南京农业大学学报,2021,44(1)：103-110.
L1 Ting  ,ZHL  W'enjiao,CHEN  Min , et  al. Cloning  and  expression  pattern  analysis  of  SmNTF3 gene  in  eggplant  [J]. Journal  of  Nanjing  Agricultural  Lniversity ,2021,44(1) ：103-110.
茄子SmNTF3基因的克隆及其表达模式分析
李婷，朱文姣，陈敏，杨清”
(南京农业大学生命科学学院，江苏南京210095)
摘要：［目的］本文旨在克隆茄子(Solanum  melongena  L.)促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因SmNTF  3，阐明其在盐和干旱 胁迫处理下的表达特性。［方法］以茄子’苏崎1号’为试验材料，克隆SmNTF3的全长序列，对其基因结构和序列同源性进 行分析，通过烟草叶片瞬时表达系统进行SmNTF3蛋白的亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR 检测SmNTF3基因在不同组 织及盐和干旱胁迫下的表达情况。［结果］SmNTF3基因开放阅读框长度为1 119 bp ，编码1个含372个氨基酸残基的蛋 白。生物信息学分析表明，该蛋白具有保守的S_TKc 结构域，富含a -螺旋和无规则卷曲。系统发育分析表明，SmNTF3属 于MAPK 家族C 组成员，其氨基酸序列具有高度保守性，与番茄和马铃薯亲缘关系最近。亚细胞定位发现,SmNTF3蛋白 在烟草叶片的细胞核和细胞质膜上表达。SmNTF3基因具有组织特异性，在茎中表达量最高。盐和干旱胁迫能够显著诱导 SmNTF3基因的上调表达。［结论］从茄子中克隆了 1个MAPK 家族C 组成员SmNTF3，该基因受盐和干旱胁迫诱导表达， 可能参与茄子对盐和干旱胁迫的响应过程。
关键词：茄子;SmNTF3基因；克隆；亚细胞定位；表达分析中图分类号:S641.1 文献标志码：A  文章编号：1000-2030( 2021) 01-0103-08
Cloning  and  expression  pattern  analysis  of  SmNTF3 gene  in  eggplant
L1 Ting,ZHU  Wenjiao,CHEN  Min,YANG  Qing *
(College  of  Life  Sciences ,Nanjing  Agricultural  University , Nanjing  210095, China)
Abstract : ［ Objectives  ］ The  paper  aimed  to  clone  mitogen-activated  protein  kinase  ( MAPK ) gene  SmNTF3 in  eggplant  and  detect  its  expression  patterns  characteristics  under  salt  and  drought  stresses. ［ Methods  ］ The  full-length  of  SmNTF3 was  cloned  from  eggplant
'Suqi  1The  gene  structure  and  sequence  homology  were  analyzed  by  bioinformatics  methods. Subcellular  localization  of  SmNTF3
protein  was  performed  with  the  tobacco  leaf  transient  expression  system. The  expression  patterns  of  SmNTF3 gene  in  different  organs
and  under  salt  and  drought  stresses  were  analyzed  using  real-time  quantitative  PCR  technique. ［ Results  ］ The  open  reading  frame  of  the
eggplant  SmNTF3 gene  was  1 119 bp  in  length , and  encoded  a  protein  of  372 amino  acid  residues  with  a  conserved  S_TKc  domain  and
the  rich  a -helices  and  irregular  curls. Phylogenetic  analysis  showed  that  SmNTF3 belonged  to  a  member  of  MAPK  fa^nily , and  the
amino  acid  sequence  of  SmNTF3 was  highly  conserved  and  had  the  closest  relationship  with  tomato  and  potato. Subcellular  localization
analysis  revealed  that  SmNTF3 protein  was  located  on  the  nucleus  and  plasma  membrane  of  tobacco  leaves. The  expression  level  of
SmNTF3 was  in  different  tissue-specific  and  high  in  stem , and  increased  under  the  salt  and  drought  treatments. ［ Conclusions  ］ 1n  this  study , SmNTF3, a  member  of  MAPK  family  C , was  cloned  from  eggplant , and  was  induced  by  salt  and  drought  stresses. The  results
indicated  that  it  may  be  involved  in  the  response  of  eggplant  to  salt  and  drought  stresses.
Keywords : eggplant  ； SmNTF3 gene  ； cloning  ； subcellular  localization  ； expression  analysis
茄子(Solanum  melongena  L.)是世界范围内广泛种植的一种农作物，含多种维生素和生物碱，营养价
值丰富并兼具药用作用。我国茄子种质资源丰富，栽培普遍，但其产量和质量极易受各种不良环境的影
响［1］。近年来，由于世界水资源的严重短缺以及保护地栽培造成的土壤盐碱化，干旱和盐胁迫已成为影
响农作物生长的重要胁迫源［2］。因此，发掘抗旱、耐盐基因对于培育抗盐、抗旱茄子品种具有重要意义。
植物面对不利胁迫时会通过多种信号传导途径进行防卫，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径 是真核生物主要存在的信号传导模块［3］。在植物中，MAPK 通路由MAPKKK(MAPKK 激酶)、MAPKK  (MAPK 激酶)和MAPK 组成，通过磷酸传递机制将上游受体与下游靶点连接起来，参与生长发育、程序性
细胞死亡以及各种环境刺激的响应［4-5］ o 已有相关研究报道YODA  (a  MAPKKK ) -MKK4/MKK5-MPK3/
收稿日期：2020-04-20
基金项目：国家自然科学基金项目(31901582)；江苏省自然科学基金项目(BK20180519)；江苏省高等学校优先级学术发展项目一一现代园
艺科学(PADH)
作者简介：李婷，硕士研究生。*通信作者：杨清，教授，研究方向为植物分子与遗传工程，E-mail ：qyang19@ njau.edu 。
104南京农业大学学报第44卷
MPK6能够有效调控花序结构［6］；MKK9-MPK6对叶片衰老过程有调节作用［7］；GhMEKK14-GhMKK11-GhMPK31通路调节棉花的干旱胁迫耐受性等［8］。
MAPK位于级联途径的下游，催化区域一般由300左右的氨基酸残基组成，该区域包含11个保守亚结构域（I—卫）和TXY双磷酸化位点⑼。根据TXY基序，植物MAPK可被分为4组（A—D），不同的序列结构参与多种生物学过程。研究表明机械损伤、干旱、低温、高盐及外源信号分子等胁迫都会诱导MAPK家族基因选择性表达［10-12］；转MAPK基因的植株能够显著增强环境抗逆性［13］，表明该家族基因广泛参与植物的胁迫响应过程。
目前,MAPK家族已在拟南芥［14］、辣椒［15］、棉花［16］、水稻［17］等多种高等植物中被鉴定和研究。烟草NTF3基因已被报道在盐和干旱胁迫诱导下表达水平显著上调［18］，但关于茄子NTF3基因的研究还未见报道。本研究从茄子'苏崎1号’中克隆得到SmNTF3基因，对其系统发育关系、亚细胞定位及盐和干旱胁迫下的表达模式进行分析，为进一步研究SmNTF3的生物学功能奠定基础。
1材料与方法
1.1植物材料与处理
茄子‘苏崎1号’为江苏普遍种植品种，购于江苏省农业科学院。将种子55C恒温水浴15min以打破休眠，消毒漂洗，平铺于MS培养基，置于光照/黑暗时间为16h/8h、昼/夜温度为（28±1）C/（25±1）C、光照强度200jimol-m_2-s_1培养箱中培育，发芽后正常光照培养。待长出4~5片真叶，取出幼苗水培1周，选取长势健康且一致的幼苗作为试验材料。每个试验重复3次。
组织样品取样：取茄子’苏崎1号’植株的主根、茎段和幼嫩叶片迅速置于液氮中冷冻保存，用于SmNTF3基因组织表达模式检测。
盐胁迫处理：将茄子幼苗浸泡在0、50、100、150、200和250mmol-L-1的NaCl培养液中12h，取叶片进行基因表达水平检测；选择响应最显著的NaCl浓度进行不同时间处理，分别于0、3、6、12、24和48h时取样，以去离子水作为对照。
干旱胁迫处理：将茄子幼苗分别浸泡在0、5%、10%,15%、20%和25%（体积分数）的PEG-6000培养液中处理12h，取叶片进行基因表达水平检测；选择响应最显著的PEG-6000水平进行不同时间处理，具体方法同盐胁迫。
1.2SmNTF3基因的克隆
采用Triozl法提取茄子总RNA，测定核酸浓度，使用Goldenstar TM RT6cDNA Synthesis Kit（擎科）的两步法反转录获得cDNA。
将烟草NTF3（NtMPK14）基因序列在茄子基因组数据库（solgenomics/）中进行BLAST比对，获得茄子同源序列Sme2.5_02990.1_g00003.1，命名为SmNTF3。以茄子叶片cDNA为模板进行扩增，引物见表1。将PCR产物连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌，阳性菌落送上海生工生物工程有限公司测序。
表1本研究所使用的引物序列
Table1Sequences of primers in this study
引物名称Name of primer引物序列Sequence of primer(5'i3')引物用途Lsage of primer
SmNTF3-F ATGGCAACTCCAGTTGAGCCAC
SmNTF3-R TCACATAACATCTCCCATTCCAGC
编码区扩增Amplification of coding region
GFP-F GFP-R GGACTAGTATGGCAACTCCAGTTGAGCC
CGGGATCCCATAACATCTCCCATTCCAGC
亚细胞定位载体Subcellular localization vector
qPCR-F AAGCTCATCCGTTGGCCATT qPCR-R CCCAAGTCCTCGTCTATGTCAAG
SmEF-1a-F CCACACTTCTCATATTGCTGTCA SmEF-1a-R ACCAGCATCACCATTCTTCAAAA
实时荧光定量PCR RT-qPCR
茄子内参基因Reference gene of eggplant
1.3生物信息学分析
利用ORF finder(v/gorf/gorf.html)进行SmNTF3基因的开放阅读框预测，用ExPASy的ProtParam程序(pasy.()rg/protparam/)对蛋白理化性质进行分析，用NetPhos3.1 (www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行磷酸化位点预测，通过SMART(blheidel-
第1期李婷，等：茄子SmNTF3基因的克隆及其表达模式分析105
berg.de/)网站进仃保寸结构域分析，用 Predict  Protein( /)和 SWISS-MODEL  (https ： // s wissmodel. expasy . org/ )进行蛋白二级和三级结构预测。
SmNTF3同源序列由NCBI 网站下载，利用DNAMAN  6.0软件进行氨基酸序列比对;MEGA  7.0软件用
于构建进化树，采用邻接法(Neighbor-joining  method)绘图‘bootstrap 设置为1 000。1.4 SmNTF3-GFP 载体的构建与亚细胞定位
将SmNTF3基因序列去除终止密码子，设计用于亚细胞定位的特异性引物(表1)，扩增目的片段并构 建克隆载体，经Spe  I 和Bam H  I 双酶切连接至载体pCAMBIA1305，构成重组质粒SmNTF3-GFP 。利用农
杆菌介导法将构建好的融合载体与Marker 共同转化烟草叶片细胞，正常培养2~3 d 后，选择长势良好的
叶片进行制片，置于激光共聚焦显微镜下观察。
1.5实时荧光定量PCR
根据SmNTF3基因序列设计特异引物，以茄子EF-1a 为内参基因，引物序列见表1。RT-qPCR 具体步
骤按照2XTSINGKE  Master  qPCR  Mix(SYBRGreenI)(擎科)说明书进行。一次平行试验设3组重复。通过 熔解曲线结果分析引物的可用性，相对定量结果以2-AA C t 计算。采用Excel  2007和SPSS  19.0软件进行数
据统计与分析。
2结果与分析
2.1茄子SmNTF3基因的克隆及测序
以’苏崎1号’叶片cDNA 为模版，扩增得到大小约1 100 bp  的目的片段(图1)o 经测序及ORF  FINDER 分析,SmNTF3长度
为1 119 bp，编码1个含有372个氨基酸残基的蛋白，该序列与茄
子基因组数据库Sme2.5_02990.1_g00003.1基因序列完全一致。
2.2 SmNTF3蛋白的结构分析
采用ProtParam 工具对SmNTF3蛋白的生化特性进行分析，
结果显示SmNTF3蛋白的相对分子质量为42 699.36，等电点为
6.32，总平均亲水系数(GRAVY)为-0.260，说明它是1个亲水
蛋白。
利用NetPhos 网站对SmNTF3蛋白序列进行磷酸化位点预
测。结果(图2)显示:SmNTF3蛋白有潜在磷酸化位点32个，丝
氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr )位点分别为15、9和8 个。其中109、188、256和313位的Ser,195位的Thr 和197位的 Tyr 磷酸化概率较高，推测是SmNTF3激酶的磷酸化位点。
对SmNTF3蛋白结构域进行分析，发现在第32~319氨基酸残基处有1个丝氨酸/苏氨酸激酶催化结
构域(S_TKc)。S_TKc 是MAPK 家族的保守结构域［19］，提示SmNTF3属于茄子MAPK 家族。
1 000
750
500
250100
bp 2 000
Marker  SmNTF3
1 119 bp
图1 SmNTF3基因的PCR 扩增产物
Fig. 1 The  PCR  product  of  SmNTF3 gene
I &p u o l o d
U O B E B o q d s o q d
丝氨酸 Serine ; ------苏氨酸 Threonine ; -------酪氨酸 Tyrosine ； -------阈值 Threshold
序列位置 Sequence  position
图2 SmNTF3磷酸化位点预测
Fig. 2 Predicted  phosphorylation  或tes  in
SmNTF3
106南京农业大学学报第44卷
蛋白二级结构分析结果（图3）显示,SmNTF3蛋白中无规则卷曲占44.35%,a -螺旋占35.75%,0-折
叠占19.89%，并具有17个蛋白结合位点。进一步对其三级结构进行分析（图4），结果显示SmNTF3折叠
交错呈复杂的三级结构，在C 端多为a -螺旋，而N 端0-折叠较多。
21 42 63 84 105 126
147 168 189
210 231 252 273 294 315 336
1 ..............................................|
|
............................................. ‘ I  ‘ 「_369
I  I  1 IT  17 I  H  T  T
Y  I  IT  i
■ III  ■ ■ ■■ ■■
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■ I  ■ ■ S ） IE  ■
■
iiiiiii  ■ ■ ii  ■ in  ill  bi  ii  11 iiiiaiui  mi  ii
图3 SmNTF3蛋白二级结构预测
Fig. 3 The  predicted  secondary  structure  of  SmNTF3 protein
2.3 SmNTF3同源性比对与进化树分析
利用NCB1数据库检索SmNTF3同源序列，对茄科及拟南
芥中的NTF3同源序列进行比对，结果（图5）显示，整体序列 相似度高达87.06%,6条氨基酸序列均具有MAPK 家族的11
个保守亚结构域，第训和第W 亚域之间存在TEY 激活位点。 SmNTF3与番茄SlMPK9（C 组MAPK ）及马铃薯StNTF3的同
源性最高（98.39%），与辣椒、烟草和拟南芥的序列同源性分别
为96.77%、96.24%和84.95%。以上结果表明SmNTF3属于
MAPK 家族C 组成员，茄科NTF3序列保守性较高。
利用MEGA  7对14个物种的NTF3蛋白序列构建系统进
化树，结果（图6）显示茄科的5种植物聚为同一分支，茄子
图4 SmNTF3三级结构模型
Fig. 4 Tertiary  structure  model  of  SmNTF3
SmNTF3S1MPK9StNTF3CaNTF3NtNTF3AtMPKl  Consensus |SFKDVYLVYKLMDTD LHQ ：[|嘲ESS
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SmNTF3S1MPK9StNTF3
CaNTF3NtNTF3AtMPKl Consensus .RHLRHENVI^LKDVMMPI].RHLRHENVULKDVMMPD  ■RHLRHENVIALKDVMMPI] ■RHLRHENVIALKDVMMPI] .RHLRHENVIALKDVMMPI]
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SRLYE MLVFEPSKRISV EALQHPYN SRLYI SAH [LAIELLQg S a H5LAIDLL<^
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S ah I lazellq  MLVFEPSKRISV EALQEPYM
smi SRLYi SRIYI MLVFDPSKRISV
MLVFEPSKRISV  MLVFEPSKRISV EALQHPYN EALQHPYL-1
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圈耐轉盹i 、i MLVFDPSKRISV EALQHPY?
SmNTF3S1MPK9StNTF3CaNTF3NtNTF3 AtMPKl  Consensus
371371371371371371
图5茄子与其他物种的NTF3氨基酸序列比对
Fig ・ 5 Alignment  of  amino  acid  sequence  of  NTF3 protein  in  eggplant  and  other  species
Sm ：茄子 Solanum  melongena  ； Sl ：番茄 Solanum  lycopersicum ( NP_001233761.1) ；St ：马铃薯 Solanum  tuberosum ( XP_006341972.1)；
Ca ：辣椒 Capsicum  annuum(XP_016568515.1) ；Nt ：烟草 Nicotiana  tabacum  ( Q40517.1) ;At ：拟南芥 Arabidopsis  thaliana  ( NP  172492.1).
下同。The  same  as  follows.
I  —卫分别表示MAPK 家族11个保守亚结构域，红方框标注出TXY 双磷酸化位点。I  -卫indicate  the  11 conserved  subdo ­
mains  of  the  MAPK  family , and  the  red  box  indicates  the  TXY  double  phosphorylation
site.
第1期李婷，等：茄子SmNTF3基因的克隆及其表达模式分析107
SmNTF3与来自番茄和马铃薯的同源序列亲缘关系最
近。除茄科外SmNTF3与大花牵牛及油橄榄等进化关
系相对较近，而与拟南芥、西葫芦、狭叶羽扇豆等亲缘关
系较远。
2.4SmNTF3亚细胞定位
在SubLoc v1.0database数据库中对SmNTF3进行
分析，预测结果显示其定位于细胞核和细胞质膜中。将
SmNTF3-GFP与Marker载体转化烟草叶片进行瞬时表达，采用激光共聚焦显微镜进行观察，结果（图7）显示，在细胞核和细胞质膜上均能看到SmNTF3-GFP融合蛋白绿荧光，且与Marker红荧光蛋白完全重叠后呈H
-----
0.01
—SH1NTF3
■jr StNTF3(XP_006341972.1)
L S1MPK9(NP_001233761.1)
--------CaNTF3(XP_016568515.1)
-NtNTF3(Q40517.1)
InNTF3(XP_019153326.1)
------------OeNTF3(XP_022852976.1)
--------------------HaNTF3(XP_021983730.1)
I——RcNTF3(XP_02416547Xl)
------FvNTF3(XP_004291845.1)
——CsNTF3(XP_006473550.1)
------------LaNTF3(XP_019459013.1)
--------------AtMPKl(NP_172492.1)
-----------------CqNTF3(XP_021759925.1)图6不同物种NTF3氨基酸序列的系统发育分析
黄，说明SmNTF3可能定位于细胞核和细胞质膜。
2・5SmNTF3基因组织表达分析
对SmNTF3基因在茄子发育过程中的组织表达模式进行分析，结果（图8）显示:SmNTF3在茎中表达量最高，显著高于根和叶，在根和叶中表达量无明显差异，说明SmNTF3在茄子中呈现组织特异性表达。Fig.6Phylogenetic analysis of amino acid sequences of NTF3from different species
In：大花牵牛Ipomoea nil；Oe：油橄榄Olea europaea var. sylvestris；Ha：向日葵Helianthus annuus；Rc：月季Rosa chinensis；Fv：野草莓Fragaria vesca subsp.vesca；Cs：甜橙Citrus sinensis；La：狭叶羽扇豆Lupinus angustifolius；Cq：西葫芦Cucurbita pepo.
SmNTF3・GFF Marker Merged GFP：核Marker
(Nuclear marker)
GFP：质膜Marker
(Plasma membrane
marker)
图7SmNTF3亚细胞定位
Fig.7Subcellular localization of SmNTF3
Bar=20ixm.
2.6SmNTF3在盐胁迫下的表达分析
从图9可知：SmNTF3的表达随NaCl处理浓度的增加呈先上升后下降的趋势，在100 mmol<L-1NaCl浓度胁迫下表达量最大，约为对照的2倍（图9-A）。选择100mmol-L-1NaCl进行不同时间处理试验，结果（图9-B）显示，盐胁迫处理3h,SmNTF3表达量显著上调，而后逐步下降，胁迫处理48h,SmNTF3的表达量与对照差异不显著。以上结果说明SmNTF3基因响应盐胁迫。
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艮Root茎Stem叶Leaf
组织Tissue
图8SmNTF3的组织表达分析
Fig.8Expression profiles of SmNTF3in eggplant *P<0.05,**P<0.01.The same as
follows.

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