以
Knockout
T M
S R 无血清培养基培养
小鼠精原干细胞的研究
3
王庆忠
(潍坊学院，山东潍坊261061)
摘　要：设计并应用了Knockout TM
SR 无血清培养基，在ST O (SI M mouse embryo -derived thi oguanine and ouabain r e sistant )饲养层上培养小鼠精原干细胞(sper m atogonial ste m cells,SS C s )。结果表明小鼠SSCs 在这一体系中能在短期内存活和形成克隆，并缓慢增殖，但不能更长时间地维持干细胞的不分化状态。
关键词：精原干细胞;Knockout T M SR;ST O 饲养层；培养
中图分类号:Q492    　文献标识码:A      文章编号:1671-4288(2008)02-0080-04  SS C s 是睾丸内具有自我复制和分化为精子潜能的干细胞，它的体外培养是精子发生机理研究和
制作转基因动物等的新途径[1,2]
。近几年的研究表明,SS C s 在体外的自我增殖需要G DNF (glia l cell line -de rived neuotr ophic fact or )因子和饲养层细胞等的支持[3-7]，并且睾丸支持细胞(Se rtoli cells )和血清都导致培养的SS C s 分化[1,
6]
。因此，使用无血清培养基培养高度纯化的SS C s 是培养成败的关键之一。然而，睾丸中的SS C s 数量极少，目前也没有
特异性的标志分子，使分离和纯化SSCs 成为重大障碍。尽管许多研究应用了磁激活细胞分选(m agnetic activated cell sorting,MACS )或荧光激活细胞分选(fluorescent ac tivated cell sorting,F ACS )，但SS C s 的富集效率并不十分理想[5,8,9]
，并且不同研究者采用了不同的包括纯化方法、培养基、饲养层等的培养体系，其他人很难重复他们的
工作。值得注意的是，我国在SSCs 培养方面的报道较少，长期培养还没有实现。为探索SS C s 体外培养的方法，我们在借鉴他人研究的基础上，试图建立自己的SS C s 培养体系。1　材料与方法
1.1　仪器和试剂
C O 2培养箱(Prec ision Scientific I nc，美国)、实体解剖镜(Motic，美国)、激光共聚焦扫描显微镜
(Le ica，德国)、低速离心机(上海安亭科学仪器厂)、自动高压消毒锅(Ya m at o，日本)、pH 计(HA NNA in 2str um ents，美国)等。
D M
E M /F12、D ME M 、腐胺、转铁蛋白、丝裂霉素
C 、丙酮酸、胰岛素、
D -(+)-葡萄糖、亚硒酸钠、DL -乳酸、β-巯基乙醇、维生素C 、胶原酶I V 、d -生物素、胰酶、DNA se 等购于Sig m a -A ldrich,L -谷
氨酰胺、青霉素、链霉素、K nockout T M
SR 基本培养基、KS R 营养补充剂、L -谷氨酰胺、ME M 维生素溶液、ME M 非必需氨基酸溶液等购于I nvitr ogen，重组人bFGF 和小鼠EGF 为BD B i osciences 产品，重组大
鼠G DNF 为R &D Syste m s 产品，透明质酸酶购于Calbi ochem ，兔抗O ct4多克隆抗体是Che m icon 产品,F I TC 偶联的山羊抗兔I gG 是Santa c r uz biotech 2nol ogy 产品，血清白蛋白为MP bi oche m icals,f or m er 2ly I CN 产品。
1.2　实验动物及处理
I CR 小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司。成年小鼠按雌雄1:1合笼，第二天早8-9时检栓，以见栓日记为怀孕0天，仔鼠出生日记作出生0天。本研究应用的是出生后4-5天的乳鼠，取乳鼠时弃掉生长弱小及过大的幼鼠，以保持实验乳鼠的整齐度。1.3　培养基和培养条件
贴壁分选培养基是以D MEM /F12为基本培养
基，添加2mmol /L -谷氨酰胺、5%F B S 、100unit /
mL 青霉素和100μg/mL 链霉素。SS C s 培养基是以
第8卷第2期                　潍坊学院学报                  Vo l .8No .2
2008年3月              Journa l of We i fang University                　Mar .2008
3收稿日期:2007-10-08
基金项目国家自然科学基金(33)
作者简介王庆忠(6—)，男，山东青州人，潍坊学院生物工程学院副教授，博士。
:000182:191
Knockout T M SR为基础培养液，添加15%KS R营养补充剂、25μg/mL胰岛素、100μg/mL转铁蛋白、60μmol/L腐胺、30n mol/L亚硒酸钠、6m g/mL D-(+)-葡萄糖、30μg/mL丙酮酸、1μL/mL DL-乳酸、1m g/mL血清白蛋白、2mmol/L-谷氨酰胺、50μmol/L Mβ-巯基乙醇、1%ME M维生素溶液、1% MEM非必需氨基酸溶液、100nmol/L维生素C、10μg/mL d-生物素、10ng/mL重组人bFGF、10ng/ mL重组大鼠G DNF、20ng/mL小鼠EGF，并称其为KSR。另有D ME M培养基用于STO细胞的培养。饲养层制备是用10μg/mL丝裂霉素C的D ME M培养基处理ST O细胞，并以5×104细胞/c m2的密度接种于预先用0.2%明胶包被的培养皿/瓶。所有细胞都在37℃、5%C O
2
条件下培养。
1.4　睾丸细胞的收集
75%酒精洗涤乳鼠，密闭致死，离体睾丸，去除白膜后进行下述操作:⑴将睾丸组织转移到15mL 离心管,PBS洗涤2-3次;⑵加10倍体积的消化液I(含0.2%胶原酶I V的D-P B S)，吸管轻轻吸打，室温下作用3-5m in;⑶P B S洗涤,170g离心2 m in，弃上清，重复2-3次;⑷加5倍体积的消化液II(分别含0.2%胶原酶I V、透明质酸酶和200g/mL DNase的无血清D ME M)，吸管轻轻吸打，室温下消化2-5m in;⑸加10倍体积的P B S,250g离心5 m in，弃上清，反复2-3次;⑹P B S重悬细胞，用60μm孔径的筛网过滤细胞悬液，滤出液于200g离心5m in，弃上清,P B S重悬,200g离心洗涤2次;⑺最后用差异贴壁分选培养基(5%F B S的D ME M/ F12)重悬细胞，接种到0.2%(W/V)明胶包被的25 cm2培养瓶或者6孔板(9.4c m2/孔)，置培养箱中培养。
1.5　SS C s的富集与培养
上述接种的细胞中主要有生精细胞和支持细胞，根据支持细胞贴壁快的特性，再采用反复贴壁法除去支持细胞。⑴在差异贴壁分选培养基中培养40m in至1h;⑵用吸管轻轻吹打，悬起生精细胞和部分支持细胞，转移到新的明胶包被的培养瓶/皿中，继续培养3-4h;⑶用同样的方法，再次悬起尚未紧密贴壁的细胞，转移到第三个新的明胶包被的培养瓶/皿中培养过夜至1天，直到睾丸体细胞完全贴壁并开始铺展生长;⑷吹打悬起生精细胞,250g 离心5m in，弃上清，以SSC s培养基重悬细胞并接种到丝裂霉素处理的ST O饲养层上培养;⑸细胞传代仍是用上述吹打悬浮细胞的方法。1.6　免疫细胞化学染分析
弃去4孔板中的培养液,P B S洗涤,4%多聚甲醛固定液室温固定20m in后，用P B S洗3次，再加封闭液室温作用45m in；加200μL1:500稀释的Oct4一抗,4℃孵育过夜;PBS洗涤后，加入1:1000稀释的F I TC偶联的山羊抗兔I gG二抗，室温避光孵育1h，然后用P B S洗涤，最后加入0.5mL P B S覆盖细胞，于激光共聚焦显微镜下观察和照相。
2　结果
2.1　适宜的细胞接种密度是富集乳鼠SS C s的关键
在混合培养时，睾丸体细胞贴壁快，而生精细胞只是贴附在已贴壁的体细胞层上，很容易吹打悬起。因此，我们通过反复贴壁与吹打悬起生精细胞的方法来富集SS C s，并称为差异贴壁分选。我们注意到，生精细胞和支持细胞在混合培养时都有相互聚集的特性，并且睾丸细胞的接种密度对这种粘附有重要影响。从图1-C可以看出，即使是培养过夜的睾丸细胞培养物，生精细胞已聚集成团。当接种密度为2×106细胞/c m2或者更高时，生精细胞与支持细胞相互粘附成致密的细胞团。这种细胞团能因其中的支持细胞的分裂而体积增大，但不能铺展于培养瓶/皿，当用胰酶消化这种培养物并重新低密度接种培养时，其中的生精细胞已呈现凋亡特征，并很快凋亡消失。当接种密度低于0.5×105细胞/c m2时，支持细胞铺展于皿底，生精细胞多单个分散附于其上，不利于将两者分离。当接种密度为2×105细胞/c m2时，生精细胞成团附于贴壁的支持细胞层上，容易通过吹打悬浮的方法分离出生精细胞。因此，差异贴壁分选富集SSCs的适宜接种密度是2×105细胞/c m2。
为确认差异贴壁分选的效率，我们以接种后直接培养过夜的培养物作为对照，与经过三次悬起生精细胞后再培养的培养物同时进行免疫细胞化学染分析，检测标志抗原是Oct4，它已被认为是SSCs 标志分子之一[10-12]。结果表明，贴壁分选高度富集了SS C s(图1)。
2.2　培养的小鼠SS C s在K SR和ST O饲养层上形成细胞克隆
在ST O细胞饲养层上，以KSR培养的富集的SS C s能够产生细胞克隆。这些克隆一般在4-24个细胞大小。细胞克隆最早出现于培养开始后的6 -7天，并随着培养时间的延长，克隆体积缓慢增大，说明这些细胞能够增殖。这些细胞克隆呈现出独特的形态特征，细胞克隆不规则，边界不清，但能
第2期                    王庆忠：以K nock out T M SR无血清培养基培养小鼠精原干细胞的研究C
观察到细胞之间有胞质桥相连。这些特征都是SS C s 所特有的，说明它们是SSCs (图2)
。
图1　培养的睾丸细胞的免疫细胞化学分析
A：直接贴壁培养过夜的睾丸细胞免疫细胞化学分析，显示只
有极少量的细胞是Oct4+
，说明睾丸细胞中SSCs 的数量是极少的;C:A 图的相差图象，可以看出培养物中有较多的睾丸细胞;B：经过三次转瓶并过夜培养分选后的睾丸细胞的免疫细胞化学分析，显示SSC s 已被富集;D:B 图的相差图象，说
明图中的细胞团基本上是O ct4+
的。图中标线:50μ
m
图2　SSC s 体外形成的细胞克隆的形态特征
A：培养6天的SSCs 克隆;B：培养10天的SSC s 克隆。(400×
)2.3　KSR 无血清培养支持SSCs 在体外的短期存活和增殖
尽管乳鼠SSCs 能够在ST O 饲养层上和添加有
G DNF 的无血清KS R 培养基中存活和缓慢地增殖，但进一步的培养研究显示，在这种培养体系中,SSCs 并不能维持长期的存活状态和增殖活性。当培养时间延长时，伴随着细胞的传代培养，细胞逐渐出现凋亡特征。一般情况下，培养至第15-16天时,SS C s
开始发生凋亡(见图3)。其实，从图2-B 可以观察到，培养10天的培养物中已出现大型的分化中的A 型精原细胞。这些结果表明，尽管培养体系中外源的G DNF，并不能抑制SS C s 的分化和凋亡。很可能在这一培养体系中，含有诱导SSCs 分化的因子，或是含有不利于SSCs 存活的物质成分。因此,K SR 无血清培养只能维持SS C s 在体外的短期存活和增殖，并不适于SSCs
的长期培养。
图3　培养16天时的生精细胞的凋亡特征
本培养体系不能维持SSC s 长期存活和增殖，一般培养到15
-16天时，细胞开始凋亡，细胞质中出现明显的凋亡小体。
3　结论与讨论
本研究建立了包括对睾丸细胞的贴壁分选、
KSR 无血清培养基和ST O 细胞饲养层为主的一种小鼠SSCs 体外培养体系。差异贴壁分选时，睾丸细胞最适宜的接种密度为2×105
细胞/c m 2
sorting out
，过高或过
低都不利于SS C s 的分离与富集;SS C s 相对富集的睾丸细胞在本研究的培养体系中能产生SSCs 克隆，并有缓慢的增殖行为，但不能更长时间地维持其在体外的自我复制和不分化状态。
Knockout TM S R 培养基是胚胎干细胞培养中常用的无血清培养基，它促进小鼠胚胎干细胞的存活
和增殖，因而广泛应用于基因敲除时胚胎干细胞的
培养。在SSCs 研究中，应用Knockout T M
S R 还未见报道。我们首次应用该培养基的研究结果表明，这种培养基虽然适用于胚胎干细胞的培养，该培养基中可能含有某些诱导SSCs 分化的因子，因而不适合于精原干细胞的体外长期维持。
参考文献:
[1]Ryu B Y,K ubota H,Ava rbock M R,et al .Conse rvati on of s perma t og onial st em cell s e lf -renewal signa ling be t w een mous e and rat[J ].Proc Natl Acad Sc iU S A,2005,102:14302-14307.
[2]Chia rini -G a rc i a H,Ray me r AM,R ussell L D .Non -rand om distributi on of s per m atog oni a in ra ts:evidence of niche s in the f []R ,3,6666[3]B ,S M ,B Y ,G DNF f y y f 2
潍坊学院学报                                        　2008年3月
se m in i e rou s t u bu les J .ep rodu cti on 20012:9-80.
u ageaw A ukhwan i en -ehu dah A et a l .am il recep t o r al p h a1p heno t p e o sp er m at o g o n i a l stem cells in i m
第2期                    王庆忠：以K nock out T M SR无血清培养基培养小鼠精原干细胞的研究
ma ture mouse t e ste s[J].B iol Reprod,2005,73:1011-1016.
[4]Ryu B Y,O r wig K E,K ubota H,et a l.Phenoty pic and functi onal cha racte ristics of s per m atog onial ste m cells in ra ts[J].D ev
B i ol,2004,274:158-170.
[5]Kubota H,AvarbockM R,B ri nster R L.Culture conditi ons and si ngle gr owth fac t ors affect fate dete r m ina ti on of mouse s pe r2 ma t ogonia l st em cells[J].B i ol R ep r od,2004,71:722-731.
[6]Kubota H,Av a rbockM R,B rinster R L.Growt h factors e ssential for se lf-renewal and ex pansion of mouse s pe r m at og onia l stem cells[J].P r oc NatlAcad Sci U S A,2004,101:16489-16494.
[7]Naught on C K,Jain S,Strickl and A M,et a l.Glial cell-line derived neurotrophi c factor-media t ed R ET signa ling regulate s s perma t og onial stem ce ll fate[J].B i ol Rep r od,2006,74:314-321.
[8]Nagano M C.Ho m i ng efficiency and p rolife ra ti on kine tics of ma l e germ li ne st em ce lls follo wing trans p l anta ti on in m ice[J].B i2 ol Reprod,2003,69:701-707.
[9]李彦锋，郭应禄，李晓红，等.人精原干细胞的磁式分选和功能鉴定[J].中华男科学杂志,2004,10(8):567-571.
[10]Nagano M,R yu B Y,B rinster C J,et a l.M aintenance of mous e m ale ger m line stem cells i n vitro.B i ol R ep r od,2003,68: 2207-2214.
[11]Zhang X,Ebata K T,NaganoM C.Gene tic analysis of the c l onal origin of regene rating mouse s perma t ogenesis foll o wing trans2 plantation[J].B iol R eprod,2003,69:1872-1878.
[12]Ogawa T,Oh m ura M,Tamura Y,et a l.Derivati on and morphologi ca l charac teriza ti on of mouse sper m at og oni a l stem ce ll lines [J].Arch Hist ol Cyt ol,2004,67:297-306.
Study on Cu ltur e of M ouse Sper m a togon i a l Stem Cells i n Ser um-Fr ee Knockout TM SR M ed i um
W ANG Q i n g-zhon g
(W e if a ng U n i ver sity,W e ifang261061,C h i na)
Abstrac t:S per m atogonia l ste m cells(SS C s),the only stem ce lls that a r e capable of trans m itting genetic inf or ma2 ti on to subsequent generations in adult ani m als,have abilities t o self-renew and differentia te into s per ma t oz oa. Theref ore,SS C s are not only the study object of ste m ce ll bi ology,but also the valuable resource of in vitr o s per2 m at ogenesis,gene ana lysis and func tiona l genom ic s.I n the present study,we designed and used a seru m-fr ee defined m edium p r epared with Knockout T M SR basa l medium to cultur e s per ma t ogonial ste m cells(SSC s)diss oc i2 a ted fr om m ice on ST O(S I M mouse e mbryo-derived thioguanine and ouaba in resistant)f eeders,and mouse SS C swere selected by differentia l adherence selecti on in D ME M/F12conta ining5%FBS.Our r e sults showed tha t enriched SS C s could be m aintained f or a short of ti m e and for m col onies,but the p r oliferati on of SSCs was uncons p icuous,suggesting that s om e fact ors tha t are detri m enta l to the self-r ene wal of SSC s possibly existed in the Knockout T M S R ba sal medium.However,the use of K SR m edium,which was widely used in the culture of embryonic ste m ce lls(ESC s),in the SS C m aintenance was the first ti m e,and our r e sults indicated that the Knockout T M SR basa l m ediu m don’t a ppr opriate for the long-ti me cultur e of SSCs.
Keyword s:sper m atogonial ste m cells,Knockout TM SR,ST O feede rs,culture
(责任编辑：梁足培)

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