食品级表达系统研究进展
食品级表达系统被定义为一套包括宿主和表达载体在内的安全的、完整的表达系统，这个表达系统所涉及到的材料和技术，包括菌株(必须来自食品级微生物GRAS)、DNA、转化和表达所使用的材料、选择标记和培养、表达条件等都必须是对环境、对人体无任何毒副作用的、可以被食品工业接受和认可的[1-3]。自从这个定义被提出后，近年来关于食品级基因工程表达系统的研究日益增多，其中研究的最多的是食品级乳酸菌表达系统。
乳酸菌是食品微生物的重要成员，是一类对人和动物健康有益的细菌，属于GRAS微生物。最近十多年来，乳酸菌表达系统的研究取得长足进步。其中食品级表达系统更是重要的研究热点。食品级表达系统是一种不依靠传统抗生素标记选择的表达系统，这类表达系统具有以下三个特点：（1）载体必须是食品级的，不得含有非食品级功能性DNA片段，传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定功能性抗生素抗性的基因，虽然为遗传操作时保持一定的选择压力，对载体的选择作用是有效的，但将抗生素抗性基因投放到环境或人和动物体内，由于抗性因子的转移，将可能引起生物安全性问题，因此，带有抗性基因的表达系统是不能在食品中应用。（2）表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物，如乳酸菌及其他已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株；（3）诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤等可被人食用的物质。目前主要作为基因工程菌的有乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。大量的克隆和表达载体被研究开发来改善基因工程乳酸菌的性能，这些基因工程乳
酸菌在奶制品和食品发酵等方面有非常大的应用前景。
然而，抗生素标记的存在使得这些基因工程乳酸菌有潜在的不安全性，因此近几年来发展了许多食品级乳酸菌表达系统，目前主要有4种方法构建食品级乳酸菌表达系统。
第一种方法是采用非抗生素抗性选择标记来构建食品级乳酸菌表达系统。应用于乳酸菌的非抗生素抗性选择标记包括显性选择标记和营养缺陷型标记。显性选择标记主要分为糖类利用标记和细菌素抗性标记两种。被选择作为基因工程乳酸菌的糖类利用标记的有蔗糖、乳糖和蜜二糖等。在乳酸菌的糖类利用标记中，以乳糖操纵子研究得最为深入。LacF基因编码可溶性酶IIA Lac，Plarteeuw 构建了LacF缺陷型Laczocoeeus lactis菌株，然后将以LacF为选择标记的表达载体转入其中，在乳糖选择平板上得到的转化子在Lac启动子的控制下可大量表达报告基因β葡萄糖苷酶[4]。LaeF作为选择标记也在Lactobacillus casei中获得成功，不同的是Gosalbes采用了两步选抒法。他先用Erythromycin筛选得到Lac-Em+菌株，然后通过同源重组去掉抗生素抗性和来自细菌的复制起点，再
通过乳糖筛选得到所需要的转化子[5]。采用乳糖和蔗糖等作为选择标记的不便之处在于自然界中具备这两种表型的乳酸菌很多，因此必须构建相应的营养缺陷性菌株，这限制了此类质粒的利用。蜜二糖是乳酸菌的一个特殊发酵底物，乳酸球菌不能利用蜜二糖。利用从Laclococcus raffinolactis和Bidobaererium longum克隆得到的能水解蜜二糖的a-半乳糖昔酶基因，Jeong和Sridhar为Lactococcus
lactis分别构建了一个基于蜜二糖发酵做为选择标记的食品级表达载体[6-7]。营养缺陷型标记也可以用来构建食品级的乳酸菌表达载体。Dickely等使用乳球菌的赭石突变抑制基因supB为选择标记构建了一个乳酸菌食品级载体pFGI，当乳酸乳球菌嘌呤生物合成途径中的基因发生赭石突变时，表现为嘌呤营养缺陷型，supB基因产物可以抑制这种营养缺陷[8]。但是pFGI在工业菌株中很不稳定且会严重抑制工业菌株的生长。在pFGI的基础上，sorensen等构建了一个适合在工业菌株中使用的食品级表达载体pFG200。pFG200以琥珀突变抑制基因为选择标记，载体内部除了一小段多克隆位点外全部由乳球菌DNA构成。在不含嘧啶的培养基中可有效地选择转入了pFG200的菌株，且转化菌株的生长不受影响[9]。使用丙氨酸消旋酶编码基因alr和天冬氨酸转氨酶基因asp C并构建相应的缺陷菌株后也可以构建营养缺陷型食品级乳酸菌表达系统[10-11].
第二种是温度控制型表达载体。Henrich基于热敏感性的pG+宿主复制子构建了2类分别含有Lactococcus laclis染体LEU操纵子和来自性因子的TEL操纵子的食品级运输载体[12]。
第三种方法是通过特异位点的同源重组来构建食品级乳酸菌表达系统。由于在构建载体的时候经常会加入一些不属于乳酸菌本身的序列，这些来自其它异源微生物比如大肠杆菌等的异源序列在某种程度上被认为是非食品级的。Martin采用抗性标记构建载体，在筛选到所需菌株后利用整合酶和β-重组酶在特异位点间的重组特性删除了抗性标记和这些异源序列，所构建的载体被称为自我克隆(self-eloing)载体[13]。
第四种方法是通过伴侣载体(或称为共转化)构建食品级表达载体。此方法涉及到两类载体，一种是能在乳酸菌中复制的载体，另一种是带有抗性标记却没有复制区的伴侣载体。当这两种载体同时被转入乳酸菌后，通过表型选择和传代培养获得不含抗性标记的转化子。
近年来，除了乳酸球菌之外的其它许多新的食品级表达系统也被开发。其中研究较多的是嗜热链球菌，它所使用的选择标记主要有α-半乳糖营酶基因和编码热激蛋白的shsp基因，另外以丙氨酸营养缺陷型和细菌素免疫基因pefl为选择标记的枯草芽抱杆菌食品级表达系统(Baeillus subtilis)和propionibacrerium freudenreichii食品级表达系统最近也被逐渐构建[14-16]。
酿酒酵母在食品工业中的应用已有数千年历史，它也是最早发展起来用于表达异源蛋白的真核基因表达系统。利用酿酒酵母表达系统已经成功的生产出了商品化的疫苗、重组酶等。对酵母的分子生物学改造包括加强酵母对淀粉的利用、构建低双乙酞、低H2S和低高级醇的酵母工程菌、提高
酵母絮凝性、增加啤酒泡沫稳定性、增加酵母发酵啤酒后的生香物质等。然而，虽然酵母工程菌在现代食品工业中的应用越来越广泛，关于工程菌的安全性也越来越受到了消费者的质疑。很多在实验室构建的酵母工程菌存在各种各样的安全和使用隐患，主要体现在酵母所使用的选择标记和酵母宿主本身两个方面。
酿酒酵母的选择标记主要有营养缺陷型和显性选择标记，但是这两种选择标记在食品发酵工业中的应
用都各有缺陷。使用营养缺陷性状标记需要先构建营养缺陷型单倍体酵母。与多倍体工业菌株相比，单倍体酵母生长缓慢、难以高密度发酵、生长过程中性状不稳定容易发生突变和衰退，因此并不适合用来生产发酵食品或者发酵型饮料。抗生素和重金属选择标记虽然适合工业酵母菌株，但是这两种选择标记都不安全，所以也不适合在食品工业中使用。基于以上种种原因，构建食品级的酿酒酵母表达系统非常必要。
目前关于构建食品级酵母表达系统的研究相对较少。Y apl基因是很多酵母基因组内相对保守的一种转录因子，属于激活保护酵母在压力下生长的基因，lwakiri等基于Y apl基因构建了假丝酵母食品级表达系统。使用来自假丝酵母本身的Y apl基因做为选择标记，将包含此标记的载体转入酵母后得到的转化子可以在含4ug/ml以上浓度的的培养基上生长[17]。虽然Iwakiri所使用的选择标记是来自假丝酵母本身，但是由于在筛选时用了，因此也不能说是完全意义上的食品级选择标记。
steele因此，要构建一种普适性的食品级基因工程表达系统，就必须到一种在野生型食品级安全微生物中一般不存在、同时本身又安全且筛选简便的标记，这仍然是将来一个时期内的研究热点和重点。
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