PCR引物设计流程
（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）
一．流程图
二．确定模板
1.确定模板来源物种
近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等
常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）
一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。
2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列
A.进入NCBI主页  bi.v/  ，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。
B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 bi.v/refseq/about/ 。
C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）。
D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions，transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。
E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。
3.整理下载的模板序列
三．寻保守区域
保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。在扩增基因序列时，选择在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因。因此，在引物设计前需先出目的序列中的保守区域。在引物设计时，则首先应在保守区域内设计引物。
1.制作mega标准序列
A.用ClustalX软件打开整理好的TXT文件（菜单File →Load Sequences），然后在菜单Alignment选项下选择Do Complement Alignment，此时将保存两种格式文件：.dnd和.aln（序列较长时耗时较长，需数分钟）。
B.将以上.aln文件用DAMBE软件打开（File→Open standard sequence file），注意选择恰当的序列类型。打开后的文件可直接转存为.meg或.fas格式文件（File→Save or Convert Sequence Format）。
注1：此时在Sequence Info对话框应选择Binary选项，否则在转换格式时T碱基会被替换为U。
2.Mega分析同源性
A.用Mega软件打开以上保存的.meg或.fas格式文件，新建一个序列对齐分析窗口（Align→Edit/Build Alignment→Retrieve sequences from a file）。
B.在新窗口中以默认设置将序列集进行序列对齐分析（Alignment→Align by muscle（Codons）），结果保存为.fas文件（Data →Export Alignment）。
C.打开网址 mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#forms::boxshade 进入在线软件BOXShade，在选择文件按钮下载入以上已对齐的模板.fas文件。
点击advanced options按钮展开选项，将默认设置进行如下图修改。其余选项保持默认即可，也可根据实际需要进行调整。设置完后点击Run提交任务。
注2：should sequence name be printed项的默认设置为YES，此时将把序列名同时打印。需再输出的富文本文件中将字体全部改为中文字体，才能保持序列的对齐。如需英文字体，此项可以改为no，序列名可以通过其他方式添加。
     
    在软件输出结果的报告页面中保存.rtf格式的富文本文件，该文件可用Microsoft Word编辑。
   
 
3.保守区域的分析
如下图，consenus行表示序列间的一致性，*号表示在序列间完全一致的碱基，.号表示在序列间高度相似的碱基，空格表示在序列间；consenus行之上每一行分别代表一个物种的PHIP基因序列，蓝背景的碱基为在物种间保守的碱基。首先观察consenus行，*号比例在50%以上且空格很少的区域可视作保守区域，具体分析中应灵活处理。以PHIP基因为例，保守区域可划分为：190-1240bp，1260-1980bp，2000-2290bp，2540-4920bp，5340-5740bp。
注3：出现连续的长的不保守区域（大于数百bp），因为引物设计产物的最佳长度上限在1000左右。此时可以只考虑近亲物种序列的保守性，降低保守区域的分析标准。

html富文本框4.绘制引物设计示意图
注4：对于PHIP基因，我们顺利的得到了保守性区域分析结果。但是，对于某些进化较快的基因，保守性区域可能不足够用于设计引物。此时，可以逐渐减少用于分析的远缘物种，采用渐进性的分析，直到得到能够设计引物的保守性区域。
注5：为什么是mega ？保守性区域的分析用其他软件（如DNAMAN）也可进行。采用mega的原因在于其分析方法的可靠性更高，同时该软件在进化分析等中也非常常用，所以将mega可读序列的制作一并说明。
四．用Primer5 软件设计引物
1.新建文件，导入模板
确定一条序列为设计引物的模板序列。本例中根据进化关系，选择鸭的PHIP基因序列为模板。在Primer5软件中新建一个窗口（File → New → DNA Sequnce），将模板序列粘贴（ctrl+v）在窗口内（一般选择as is表示粘贴原序列，也可根据需要粘贴反向序列等）。

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