ｄｏｉ：１０．１１６５９／ｊｊｓｓｘ．１１Ｅ０２１０４９
·基础研究·
Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ抑制凋亡通路对体外培养玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的影响
卢美蓉１，王　静１，黄广翅１，李桂花１，刘秀盈２，蔡杏琳３　（１．海南现代妇女儿童医院妇产科，海南海口５７０１００；２．海南现代
妇女儿童医院检验科，海南海口５７０１００；３．海南医学院第一附属医院产科，海南海口５７０１０２）
［摘　要］　目的　探讨通过泛Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ抑制凋亡通路对体外培养玻璃化冷冻未成熟卵母细胞（ＶＩＯｓ）的ＤＮＡ完整性和发育潜能的影响。方法　取２００只雌性ＩＣＲ小鼠未成熟卵丘—卵母细胞复合体（ＣＯＣｓ）。实验Ⅰ：将未成熟ＣＯＣｓ分为阴性对照组（
ＦＯｓ组，ｎ＝３１，新鲜ＣＯＣｓ）、阳性对照组（ＨＰＯｓ组，ｎ＝３２，过氧化氢暴露ＣＯＣｓ约３ｈ）、２ｈＶＩＯｓ组（ｎ＝３１，玻璃化复苏ＣＯＣｓ２ｈ）、１８ｈＶＩＯｓ组（ｎ＝３２，玻璃化复苏ＣＯＣｓ１８ｈ），探讨玻璃化冷冻对未成熟卵母细胞凋亡通路的影响。实验Ⅱ：将未成熟ＣＯＣｓ分为ＶＩＯｓ（－／－）组（ｎ＝３６，未加入Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ）、ＶＩＯｓ（＋／－）组
（ｎ＝３７，仅在玻璃化冷冻复苏培养基中添加Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ）和ＶＩＯｓ（＋／＋）组（ｎ＝３４，在玻璃化冷冻复苏培养基和复苏后培养基中均添加Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ），复苏后孵育１８ｈ进行染，探讨Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ对凋亡标志物［未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化（ＴＵＮＥＬ阳性卵母细胞百分比）、Ｃａｓｐａｓｅ活性］的影响。实验Ⅲ：将未成熟ＣＯＣｓ分为ＦＯｓ组（ｎ＝１３０）、ＶＩＯｓ（－／－）组（ｎ＝１２９）和ＶＩＯｓ（＋／＋）组（ｎ＝１２８），分组操作同上，分析Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ对ＶＩＯｓ体外发育潜能的影响。结果　实验Ⅰ结果显示，ＨＰＯｓ组、１８ｈＶＩＯｓ组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例高于ＦＯｓ组（Ｐ＜０．０５）；１８ｈＶＩＯｓ组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例高于２ｈＶＩＯｓ组（Ｐ＝０．０２３），低于ＨＰＯｓ组（Ｐ＝０．００４）；ＨＰＯｓ组、２ｈＶＩＯｓ组和１８ｈＶＩＯｓ组Ｃａｓｐａｓｅ活性均高于ＦＯｓ组（Ｐ＝０．００１），但是ＨＰＯｓ组、２ｈＶＩＯｓ组和１８ｈＶＩＯｓ组Ｃａｓｐａｓｅ活性比较，差异无统计学意义（
Ｐ＞０．０５）。实验Ⅱ结果显示，与ＶＩＯｓ（－／－）组相比，ＶＩＯｓ（＋／－）组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例较低（Ｐ＝０．００７）；ＶＩＯｓ（＋／＋）组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例和Ｃａｓｐａｓｅ活性低于ＶＩＯｓ（＋／－）组和ＶＩＯｓ（－／－）组（Ｐ＜０．００１），但ＶＩＯｓ（＋／－）组和ＶＩＯｓ（－／－）组Ｃａｓｐａｓｅ活性比较差异无统计学意义（Ｐ＝０．５８８）。实验Ⅲ结果显示，ＶＩＯｓ（＋／＋）组成熟率、受精率与ＦＯｓ组和ＶＩＯｓ（－／
－）组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），但ＶＩＯｓ（＋／＋）组和ＶＩＯｓ（－／－）组闭锁率高于ＦＯｓ组（
Ｐ＜０．００１）；ＶＩＯｓ（－／－）组和ＶＩＯｓ（＋／＋）组５～８细胞、９～１６细胞胚胎发育率均低于ＦＯｓ组（Ｐ＜０．００１）；在胚胎发育后期，ＶＩＯｓ（－／－）组和ＶＩＯｓ（＋／＋）组均无囊胚形成，与ＦＯｓ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　玻璃化冷冻提高了ＶＩＯｓ的凋亡标志物水平，而Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ能够抑制ＤＮＡ损伤和Ｃａｓｐａｓｅ活性，但其可能并不是胚胎发育的决定因素。
［关键词］细胞凋亡；超低温保存；玻璃化冷冻；未成熟卵母细胞；ＤＮＡ完整性；发育潜能［中图分类号］Ｑ９５４．４　［文献标识码］Ａ　［收稿日期］２０２１ １１ ０９
　［基金项目］海南省卫生计生行业科研项目（１９Ａ２００１８１）
　［通信作者］卢美蓉，Ｅ ｍａｉｌ：ｓａｖ２１２６＠１６３．ｃｏｍ
ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓｐａｔｈｗａｙｂｙＺ ＶＡＤ ＦＭＫｏｎｖｉｔｒｉｆｉｅｄｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓｉｎｖｉｔｒｏ
ＬＵＭｅｉ ｒｏｎｇ１，ＷＡＮＧＪｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧＧｕａｎｇ ｃｈｉ１，ＬＩＧｕｉ ｈｕａ
１，ＬＩＵＸｉｕ ｙｉｎｇ２，ＣＡＩＸｉｎｇ ｌｉｎ３　（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ
ａｎｄＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，ＨａｉｎａｎＭｏｄｅｒｎＷｏｍｅｎａｎｄＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＨａｉｋｏｕＨａｉｎａｎ５７０１００，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｉｎａｎＭｏｄｅｒｎＷｏｍｅｎａｎｄＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＨａｉｋｏｕＨａｉｎａｎ５７０１００，Ｃｈｉｎａ；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨａｉｎａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨａｉｋｏｕＨａｉｎａｎ５７０１０２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓｐａｔｈｗａｙｂｙｐａｎ ＣａｓｐａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒＺ ＶＡＤ ＦＭＫｏｎｔｈｅＤＮＡｉｎｔｅｇｒｉｔｙａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｖｉｔｒｉｆｉｅｄｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓ（ＶＩＯｓ）ｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅｃｕｍｕｌｕｓ ｏｏｃｙｔｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ＣＯＣｓ）ｏｆ２００ｆｅｍａｌｅＩＣＲｍｉｃｅｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔⅠ：ｔｈｅｉｍｍａｔｕｒｅＣＯＣｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＦＯｓｇｒｏｕｐ，ｎ＝３１，ｆｒｅｓｈＣＯＣｓ），ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏ
ｕｐ（ＨＰＯｓｇｒｏｕｐ，ｎ＝３２，ＣＯＣｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｆｏｒ３ｈｏｕｒｓ），ｔｈｅ２ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐ（ｎ＝３１，ＣＯＣｓｗｉｔｈｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｆｏｒ２ｈｏｕｒｓ）ａｎｄｔｈｅ１８ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐ（ｎ＝３２，ＣＯＣｓｗｉｔｈｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｆｏｒ１８ｈｏｕｒｓ），ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｐａｔｈｗａｙｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔⅡ：ｔｈｅｉｍｍａｔｕｒｅＣＯＣｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）ｇｒｏｕｐ（ｎ＝３６，ｗｉｔｈｏｕｔＺ ＶＡＤ ＦＭＫ），ｔｈｅＶＩＯｓ（＋／－）ｇｒｏｕｐ（ｎ＝３７，ｗｉｔｈＺ ＶＡＤ ＦＭＫｉｎｔｈｅｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｒｍｉｎｇｍｅｄｉａ）ａｎｄｔｈｅＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐ（ｎ＝３４，ｗｉｔｈＺ ＶＡＤ ＦＭＫｉｎｔｈｅｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｒｍｉｎｇｍｅｄｉａａｎｄｐｏｓｔｗａｒｍｉｎｇｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ）．Ｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄａｆｔｅｒｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎａｎｄｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｆｏｒ１８ｈｏｕｒｓ，ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＺ ＶＡＤ ＦＭＫｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｍａｒｋｅｒｓ［ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ５
８６局解手术学杂志　ＪＲＥＧＡＮＡＴＯＰＥＲＳＵＲＧ　２０２２，３１（７）    ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｊｓｓｘｚｚ．ｃｎ
ｏｆＴＵＮＥＬｐｏｓｉｔｉｖｅｏｏｃｙｔｅｓ）ａｎｄＣａｓｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓ］．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔⅢ：ｔｈｅｉｍｍａｔｕｒｅＣＯＣｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅＦＯｓｇｒｏｕｐ（ｎ＝１３０），ｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１２９）ａｎｄｔｈｅＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１２８），ｔｈｅｇｒｏｕｐｉｎｇｏｐｅｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｔｈｅｓａｍｅａｓａｂｏｖｅ，ａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＺ ＶＡＤ ＦＭＫｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＶＩＯｓｉｎｖｉｔｒｏｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔⅠｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅＨＰＯｓｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅ１８ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅＦＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）；ｔｈｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅ１８ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅ２ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＝０．０２３），ａｎｄｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅＨＰＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＝０．００４）．ＴｈｅＣａｓｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅＨＰＯｓｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ２ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅ１８ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅＦＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＝０．００１），ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｔｈｅＨＰＯｓｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ２ｈＶＩＯｓ
ｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅ１８ｈＶＩＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５）．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔⅡｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅＶＩＯｓ（＋／－）ｇｒｏｕｐｗａｓｌｏｗｅｒ（Ｐ＝０．００７）．ＴｈｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓａｎｄＣａｓｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅＶＩＯｓ（＋／－）ｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．００１），ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎＣａｓｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＶＩＯｓ（＋／－）ｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）ｇｒｏｕｐ（Ｐ＝０．５８８）．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔⅢｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＶＩＯｓｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｓｉｎｔｈｅＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐｗｅｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅＦＯｓｇｒｏｕｐｏｒｔｈｅＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５），ｂｕｔｔｈｅｃｌｏｓｕｒｅｒａｔｅｓｉｎｔｈｅＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）ｇｒｏｕｐｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅＦＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｅｍｂｒｙｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｒａｔｅｓｏｆ５ｔｏ８ｃｅｌｌｓａｎｄ９ｔｏ１６ｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）
ｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅＦＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．００１）．Ａｔｔｈｅｌａｔｅｒｓｔａｇｅｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＶＩＯｓ（－／－）ｇｒｏｕｐｏｒＶＩＯｓ（＋／＋）ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｃｈｈａｄｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｔｈｅＦＯｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＶｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｍａｒｋｅｒｓｌｅｖｅｌｓｏｆＶＩＯｓ，ｗｈｉｌｅＺ ＶＡＤ ＦＭＫｃａｎｉｎｈｉｂｉｔＤＮＡｄａｍａｇｅａｎｄＣａｓｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｂｕｔｉｔｍａｙｂｅｎｏｔａｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｉｍｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓ；ＤＮＡｉｎｔｅｇｒｉｔｙ；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｏｔｅｎｔｉａｌ
  卵母细胞超低温保存是保持生育能力的重要策略［１］。然而促性腺激素刺激卵母细胞成熟可能并不适合所有有保存生育能力需求的女性，如多囊卵巢综合征或激素依赖性癌症患者［２］，对这类患者可在没有激素刺激的情况下从卵巢中采集未成熟的卵母细胞［３］。但玻璃化冷冻未成熟卵母细胞（ｖｉｔｒｉｆｉｅｄｉｍｍａ ｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓ，ＶＩＯｓ）经过多次冷冻后，会影响其减数分裂和
复苏后正常发育能力的恢复，同时超低温保存可能会诱导细胞凋亡［４ ５］。有研究发现，添加抗冻蛋白或抑制信号转导调控因子可有效提高ＶＩＯｓ的发育能力，并且在猪ＶＩＯｓ中被证明是适用、有效的方法［５ ６］。半胱氨酸蛋白酶Ｃａｓｐａｓｅ是细胞凋亡过程中参与蛋白水解和ＤＮＡ断裂的效应酶，Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ是一种广谱细胞渗透性Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂，已成功用于逆转猪和牛胚胎及不同体细胞经冷冻诱导的凋亡变性［６ ７］。本研究旨在探讨Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ抑制凋亡通路对体外培养小鼠未成熟ＶＩＯｓ的ＤＮＡ完整性和发育潜能的影响，以期为临床提供参考。
１　材料与方法
１．１　实验动物
２００只雌性ＳＰＦ级ＩＣＲ小鼠，５～６周龄，购自上海亓上生物医学科技有限公司［生产许可证号：ＳＣＸＫ（沪）２０２１ ０００４］。将小鼠置于２２～２８℃、光照／避光交替１２ｈ环境下饲养，保证食物和水充足。本研究经海南医学院第一附属医院实验动物伦理委员会批准（ＬＨＫ２０１９０１２）。除另有说明，本研究所有化学品和试剂均购自美国Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ公司。
１．２　未成熟卵母细胞的获取
２００只雌性ＩＣＲ小鼠腹腔注射５ＩＵ孕马血清促性腺激素超排，４８ｈ后颈椎脱位处死。取卵巢，
置于１ｍＬ改良小鼠输卵管液中，加入２０％（Ｖ／Ｖ）牛血清白蛋白，穿刺有腔卵泡，收集覆盖有致密卵丘细胞的未成熟卵丘—卵母细胞复合体（ｃｕｍｕｌｕｓ ｏｏｃｙｔｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＣＯＣｓ）。
１．３　未成熟ＣＯＣｓ的玻璃化冷冻和复苏［８］
玻璃化冷冻：将未成熟ＣＯＣｓ悬浮于含有７．５％（Ｖ／Ｖ）乙二醇、７．５％ＤＭＳＯ的平衡溶液中培养５ｍｉｎ，然后移至含１５％（Ｖ／Ｖ）乙二醇、１５％（Ｖ／Ｖ）丙三醇、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液和２０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ的ＴＣＭ １９９培养基中，置于冷冻薄膜聚丙烯带４５～６０ｓ。将５～６个卵母细胞装入ＣｒｙｏＴｏｐ，并立即投入液氮中贮存。复苏：冷冻薄膜在３７℃含有１ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖解冻溶液及２０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ的ＴＣＭ １９９培养基中浸泡１ｍｉｎ，提取玻璃化冷冻的卵母细胞，并移至含有０．５ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液和２０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ的ＴＣＭ １９９培养基中培养３ｍｉｎ，然后在不含蔗糖的ＴＣＭ １９９培养基中培养５ｍｉｎ。
６
８
６局解手术学杂志　ＪＲＥＧＡＮＡＴＯＰＥＲＳＵＲＧ　２０２２，３１（７）    ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｊｓｓｘｚｚ．ｃｎ
１．４　ＣＯＣｓ分组
实验Ⅰ用于探讨玻璃化冷冻是否诱导未成熟卵母细胞凋亡通路的激活：将未成熟ＣＯＣｓ分为阴性对照组（ＦＯｓ组，ｎ＝３１，新鲜ＣＯＣｓ）、阳性对照组（ＨＰＯｓ组，ｎ＝３２，１００μｍｏｌ／Ｌ过氧化氢溶液暴露ＣＯＣｓ约３ｈ诱导细胞凋亡）、２ｈＶＩＯｓ组（ｎ＝３１，玻璃化复苏ＣＯＣｓ２ｈ）和１８ｈＶＩＯｓ组（ｎ＝３２，玻璃化复苏ＣＯＣｓ１８ｈ）。由于在复苏后Ｃ
ＯＣｓ可能开始缓慢闭锁，应在孵育后２ｈ及１８ｈ（小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的标准时长）对ＶＩＯｓ进行分析。实验Ⅱ用于探讨Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ对凋亡标志物（未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化、Ｃａｓｐａｓｅ活性）的影响：将ＣＯＣｓ分为ＶＩＯｓ（－／－）组（ｎ＝３６，正常玻璃化冷冻复苏培养基，未添加Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ）、ＶＩＯｓ（＋／－）组（ｎ＝３７，添加２０μｍｏｌ／ＬＺ ＶＡＤ ＦＭＫ至玻璃化冷冻复苏培养基中）和ＶＩＯｓ（＋／＋）组（ｎ＝３４，添加２
０μｍｏｌ／ＬＺ ＶＡＤ ＦＭＫ至玻璃化冷冻复苏培养基和复苏后培养基中），复苏后的ＶＩＯｓ孵育１８ｈ，随后进行凋亡标志物检测。泛Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ购自美国ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ公司，其在所有玻璃化冷冻—复苏溶液和体外成熟培养液中的最终浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ［尽量使ＤＭＳＯ浓度低于０．１％（Ｖ／Ｖ），以避免细胞毒性］。实验Ⅲ主要分析Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ对ＶＩＯｓ体外发育潜能的影响：将ＣＯＣｓ分为ＦＯｓ组（ｎ＝１３０）、ＶＩＯｓ（－／－）
组（ｎ＝１２９）和ＶＩＯｓ（＋／＋）组（ｎ＝１２８），分组操作同上，评估ＶＩＯｓ的发育能力。１．５　凋亡信号检测
采用ＣｅｌｌＭｅｔｅｒＴＭＴＵＮＥＬ凋亡检测试剂盒（美国
xposedＡＡＴＢｉｏｑｕｅｓｔ公司）和ＣｅｌｌＥｖｅｎｔＴＭＣａｓｐａｓｅ ３／７Ｇｒｅｅｎ
检测试剂（意大利ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）于３８．５℃对卵母细胞进行染，孵育１ｈ，检测未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化（ＴＵＮＥＬ阳性卵母细胞百分比）和Ｃａｓｐａｓｅ活性；再用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２或ＤＡＰＩ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）进行复染以确定细胞核；载玻片用抗褪
试剂（ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＴＭ
ＡｑｕｅｏｕｓＭｏｕｎｔｉｎｇ培养液）覆
盖，在配备数码相机（ＡｘｉｏＣａｍＭＲｃ５，德国Ｚｅｉｓｓ）的荧光显微镜（
Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００，德国Ｚｅｉｓｓ）下观察，计算ＴＵＮＥＬ阳性卵母细胞数量（细胞核区域显示亮红荧光）以及Ｃａｓｐａｓｅ活性（即绿荧光），使用成像软件ＺＥＮ２．５ｂｌｕｅ版（德国ＣａｒｌＺｅｉｓｓＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）计算荧光强度。
１．６　体外胚胎培养［
９］卵母细胞于可控环境（３９℃、５％ＣＯ２
）及２０μＬ未成熟卵培养液（ＴＣＭ １９９培养基中添加３ｍｇ／ｍＬ牛血清白蛋白、０．１ｍｇ／ｍＬ半胱氨酸、１．４ｍｇ／ｍＬ羟乙基哌嗪乙磺酸、０．２５ｍｇ／ｍＬ丙酮酸钠、０．６ｍｇ／ｍＬ乳酸钠、０．１５ｍｇ／ｍＬ左旋谷氨酰胺、０．０５５ｍｇ／ｍＬ庆大霉素、０．２ＩＵ／ｍＬ人促黄体激素和０．５ＩＵ／ｍＬ人垂体促卵泡刺激激素）中培养１８ｈ；体外成熟培养液中培养１８ｈ后，将卵母细胞从体外成熟培养皿中转移到５０μＬ新鲜体外受精培养基中，培养皿上覆盖矿物油。体外受精采用成年雄性小鼠常规睾丸切除术后获得的新鲜附睾精子。实验前睾丸于４℃中保存２４ｈ，从睾丸中解剖附睾，从输精管和附睾尾中获取精子，用体外受精培养液重悬，３０μｍ过滤器过滤精子悬液，通过Ｂüｒｋｅｒ血细胞计数盘测定精子的运动状态和浓度；将精子悬液添加到含卵母细胞的微滴中至１００μＬ，最终
运动精子浓度为１×１０６
／ｍＬ。每个试管受精液中含有
来自同一实验组的７～
１１个卵母细胞。卵母细胞和精子在可控环境中（３９℃、５％ＣＯ２）共孵育。体外受精后，所有卵母细胞在体外培养（ｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｅ，ＩＶＣ）培养基（Ｈａｍ’ｓＦ １０中添加５％ＦＢＳ、０．１１ｍｇ／ｍＬ丙酮酸钠、０．０７５ｍｇ／ｍＬ左旋谷氨酰胺、０．６ｍｇ／ｍＬ庆大霉素）中轻轻洗涤，使用剥离器微量吸液管去除精子和残余卵丘细胞后，将胚胎移至覆盖矿物油的ＩＶＣ培养基中培养１２０ｈ。ＩＶＣ期间，在高倍倒置显微镜下评估胚胎发育情况，每２４ｈ１次。１．７　成熟率、受精率和胚胎发育率
体外受精４８ｈ后，用配有１２５μｍ尖头的剥离器微量移液管机械置换未分裂的卵母细胞，与精子结合后置于载玻片上，于４℃、８０％乙醇中固定过夜。然后通过碘化丙啶染（１ｍｇ／ｍＬ，１∶１００）评估染质构型。生长中的胚胎培养至１２０ｈ或出现闭锁迹象时，用碘化丙啶染，根据卵裂球核的数量确定其发育阶段。未受精卵母细胞的成熟期（中期Ⅱ）通过存在一组紧密排列的染体（第一极体）和另一组分布良好的染体来确定。体外成熟卵母细胞总数为未受精成熟阶段卵母细胞、受精卵母细胞（即未分裂但显示原核）和卵裂胚的总和；受精卵母细胞的数量为受精卵母细胞和卵裂胚的总和。通过记录卵裂胚（２～４细胞、
５～８细胞、９～１６细胞）、桑葚胚和囊胚阶段评估胚胎发育情况，计算成熟率、受精率和胚胎发育率。１．８　统计学分析
采用ＳＰＳＳ２６．０软件进行数据处理。分类变量以
率（％）表示，采用χ２检验或Ｆｉｓｈｅｒ精确检验。连续变
７
８６局解手术学杂志　ＪＲＥＧＡＮＡＴＯＰＥＲＳＵＲＧ　２０２２，３１（７）    ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｊｓｓｘｚｚ．ｃｎ
量以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Ｄｗａｓｓ Ｓｔｅｅｌ Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ Ｆｌｉｇｎｅｒ。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结果
２．１　玻璃化冷冻对未成熟卵母细胞凋亡通路的影响
（实验Ⅰ）
  ＨＰＯｓ组和１８ｈＶＩＯｓ组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例高于ＦＯｓ组（Ｐ＜０．０５）；１８ｈＶＩＯｓ组ＤＮＡ片段化比例低于ＨＰＯｓ组（Ｐ＝０．００４），高于２ｈＶＩＯｓ组（Ｐ＝０．０２３）；２ｈＶＩＯｓ组ＤＮＡ片段化比例低于ＨＰＯｓ组（Ｐ＜０．００１），但是与ＦＯｓ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ＨＰＯｓ组、２ｈＶＩＯｓ组和１８ｈＶＩＯｓ
组Ｃａｓｐａｓｅ活性（绿荧光强度）均高于ＦＯｓ组（Ｐ＝０．００１），但是ＨＰＯｓ组、２ｈ
ＶＩＯｓ组和１８ｈＶＩＯｓ组Ｃａｓｐａｓｅ活性比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），见表１、图１。
表１　未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化和Ｃａｓｐａｓｅ活性
组别ｎＤＮＡ片段化／个（％）Ｃａｓｐａｓｅ活性ＦＯｓ组３１３（９．６８）
１９９．６±１７８．３
ＨＰＯｓ组３２３０（９０．９１）
４２０．１±３４６．１
２ｈＶＩＯｓ组３１　９（２９．０３）＃３２１．７±２１２．３ １８ｈＶＩＯｓ组
３２
　１９（５９．３８）
＃△４１４．６±３２６．８
：
与ＦＯｓ组相比，Ｐ＜０．０５；＃：与ＨＰＯｓ组相比，Ｐ＜０．０５；△：
与２ｈＶＩＯｓ组相比，Ｐ＜０．０
５ａ：ＴＵＮＥＬ染和Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染（亮蓝荧光表示细胞核，胞核中的亮红荧光表示未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化）；ｂ：Ｃａｓｐａｓｅ活性检测（绿荧光表示Ｃａｓｐａｓｅ活性程度，蓝荧光表示ＤＡＰＩ核染）
图１　未成熟卵母细胞染图
２．２　Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ对凋亡标志物的影响（实验Ⅱ）  与ＶＩＯｓ（－／－）组相比，ＶＩＯｓ（＋／－）组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例较低（Ｐ＝０．００７）。ＶＩＯｓ（＋／＋）组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例和Ｃａｓｐａｓｅ活性低于ＶＩＯｓ（＋／－）组和ＶＩＯｓ（－／－）组（Ｐ＜０．００１），但ＶＩＯｓ（＋／－）组和ＶＩＯｓ（－／－）组Ｃａｓｐａｓｅ活性比较差异无统计学意义（Ｐ＝０．５８８），见表２。
表２　未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化和Ｃａｓｐａｓｅ活性
组别
ｎ未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化／个（％）Ｃａｓｐａｓｅ活性ＶＩＯｓ（－／－）组３６２５（６９．４４）
４３４．５±２４８．３ＶＩＯｓ（＋／－）组３７１４（３７．８４）
６５３．９±５９１．６
ＶＩＯｓ（＋／＋）组
３４
　３（８．８２）
＃　２４３．７±１０６．９
＃
：与ＶＩＯｓ（－／－）组相比，Ｐ＜０．０５；＃：与ＶＩＯｓ（＋／－）组相比，Ｐ＜０．０５
８８６局解手术学杂志　ＪＲＥＧＡＮＡＴＯＰＥＲＳＵＲＧ　２０２２，３１（７）    ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｊｓｓｘｚｚ．ｃｎ
２．３　Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ对ＶＩＯｓ体外发育潜能的影响（实验Ⅲ）与ＦＯｓ组相比，ＶＩＯｓ（－／－）组成熟率较低（Ｐ＝０．００４），而ＶＩＯｓ（＋／＋）组成熟率与ＶＩＯｓ（－／－）组、ＦＯｓ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．３８４、０．０６０）。各组受精率比较，差异均无统计
学意义（Ｐ＝０．０８２）。ＶＩＯｓ（＋／＋）组和ＶＩＯｓ（－／－）组闭锁率高于ＦＯｓ组（Ｐ＜０．００１），但ＶＩＯｓ（＋／＋）组与ＶＩＯｓ（－／－）组比较差异无统计学意义（Ｐ＝０．５５０），见表３。此外，ＶＩＯｓ（－／－）组和ＶＩＯｓ（＋／＋）组的２～４细胞胚胎发育率比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），但５～８细胞、９～１６细胞胚胎发育率及桑葚胚发育率均低于ＦＯｓ组（Ｐ＜０．００１），各组２～４细胞胚胎发育率比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；在胚胎发育后期，ＶＩＯｓ（－／－）组和ＶＩＯｓ（＋／＋）组均无囊胚形成，与ＦＯｓ组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表４。
表３　ＶＩＯｓ成熟、受精和闭锁情况比较［个（％）］
组别ｎ成熟受精闭锁
ＦＯｓ组１３０８５（６５．３８）６８（５２．３１）１８（１３．８５）ＶＩＯｓ（－／－）组１２９６１（４７．２９） ５３（４１．０９）５０（３８．７６） ＶＩＯｓ（＋／＋）组１２８６９（５３．９１）５７（４４．５３）４５（３５．１６）
：与ＦＯｓ组相比，Ｐ＜０．０５
表４　体外胚胎发育情况比较［个（％）］
组别ｎ２～４
细胞
５～８
细胞
９～１６
细胞
桑葚胚囊胚
ＦＯｓ组    ８５６２（７２．９４）５３（６２．３５）　４２（４９．４１）　３０（３５．２９）　１３（１５．２９）ＶＩＯｓ（－／－）组６１４１（６７．２１）１２（１９．６７） ４（６．５６） １（１．６４） ０（０） ＶＩＯｓ（＋／＋）组６８４４（６４．７１）２０（２９．４１） ６（８．８２） １（１．４７） ０（０）
：与ＦＯｓ组相比，Ｐ＜０．０５
３　讨论
为了克服ＶＩＯｓ的体外成熟和胚胎发育不良的问题，既往研究主要集中于改进玻璃化冷冻过程［４ ６］。而本研究通过靶向凋亡途径证实了泛Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ可抑制未成熟卵母细胞玻璃化冷冻诱导的ＤＮＡ损伤和Ｃａｓｐａｓｅ的活性，从而使ＶＩＯｓ的成熟率接近于新鲜卵母细胞的成熟率。
活性氧类物质（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）是正常细胞氧化过程的副产物。精子、卵母细胞和胚胎都会积累大量ＲＯＳ，从而导致线粒体损伤、三磷酸腺苷耗竭、细胞凋亡和发育障碍［１０］，从而影响冷冻卵母细胞和胚胎的发育能力。本研究通过过氧化氢溶液诱导超低温保存的未成熟卵母细胞凋亡，结果显示未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化超过９０％。在卵母细胞凋亡过程中，Ｃａｓｐａｓｅ发挥着关键作用。Ｃａｓｐａｓｅ蛋白酶虽然可以裂解其他多种多肽成分，但是其本身通常也需要被其他酶（如级联中的其他Ｃａｓｐａｓｅ）裂解才能激活［１１］。Ｃａｓｐａｓｅ活性增加导致一些细胞成分被破坏，从而激活典型的细胞凋亡途径。根据Ｃａｓｐａｓｅ在级联反应中的功能，Ｃａｓｐａｓｅ可分为启动子（如Ｃａｓｐａｓｅ８和Ｃａｓｐａｓｅ９）和效应子（如Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃａｓｐａｓｅ６和Ｃａｓｐａｓｅ７）［１２］。本研究实验Ⅰ结果显示，无论孵育时间长短，ＶＩＯｓ组中Ｃａｓｐａｓｅ活性均高于ＦＯｓ组；２ｈＶＩＯｓ组与ＦＯｓ组的未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例相似，而１８ｈＶＩＯｓ组未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例明显高于ＦＯｓ
组。因此，在复苏后不久，Ｃａｓｐａｓｅ的活性就可以被检测到，但有些酶可能需要更长的时间才能到达细胞核，并开始ＤＮＡ片段化。关于细胞凋亡参与ＶＩＯｓ复苏后的闭锁机制在其他多个物种中也有报道［４ ５］。我们推测，通过作用于凋亡级联反应成分可能有利于ＶＩＯｓ的生存和发育。本研究将Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ用于ＣＯＣｓ玻璃化冷冻复苏和／或玻璃化冷冻复苏及次日培养，结果显示，ＶＩＯｓ（＋／＋）组Ｃａｓｐａｓｅ活性和未成熟卵母细胞ＤＮＡ片段化比例低于ＶＩＯｓ（＋／－）组，说明仅在玻璃化冷冻复苏过程中添加Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ不足以避免ＤＮＡ损伤，而在孵育１８ｈ过程中再次添加Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ可以显著降低Ｃａｓｐａｓｅ活性，减少ＤＮＡ损伤。这可能是由于Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂通过与Ｃａｓｐａｓｅ的催化位点结合并抑制其活性而发挥作用，只在玻璃化冷冻复苏过程中添加Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂暴露时间较短，延长Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ的时间有利于抑制凋亡通路的激活。Ｎｉｕ等［７］研究证实，体外培养玻璃化卵母细胞暴露于特定的Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂中可降低Ｃａｓｐａｓｅ活性并提高发育能力，本研究结果与之一致。因此，Ｃｒｙｏｔｏｐ玻璃化结合ＩＶＭ ＩＶＦ ＩＶＣ方案对低温保存的卵母细胞体外胚胎培养可能是一个很好的方案。然而，本研究发现在胚胎发育中，ＶＩＯｓ（＋／＋）组和ＶＩＯｓ（－／－）组受精率和闭锁率无统计学差异，发育后期进展较差，特别是桑葚胚和囊胚阶段，说明Ｚ ＶＡＤ ＦＭＫ有利于体外成熟培养，可能是因为抑制剂的存在阻止了后期（即体外受精后）的闭锁［４，１３ １５］。另外，在培养过程中，不能进一步发育的胚胎细胞分裂停止并开始闭锁，而凋亡抑制剂的存在可能会抑制这一过程［１６］。有研究发现，添加凋亡抑制剂至培养基可以提高胚胎发育率［１７ １８］。
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