进化树分析步骤
一、用CLUSTALX（1.83）排列序列（alignment）
方法：
1、打开记事本，以FASTA格式粘贴序列到记事本，所有要比对的序列都这么粘贴，格式如下：
>aa （序列名称）
aaagggtttttcccc（序列）
>bb
aaagggtttttcccc
>cc
aaagggtttttcccc
2、用ClustalX打开记事本文件。导入第一个文件用load sequence, 后面的文件用append sequence。都在file下拉菜单里。
3、用ClustalX排序后，输出格式为*.PHY，保存。用记事本打开如下图：
图中的8和50分别表示8个序列和每个序列有50个碱基。
二、phylip软件进行进化树分析
1、打开软件SEQBOOT
路径输入刚才生成的 *.PHY文件，并在Random number seed (must be odd) ?的下面
输入一个4N+1的数字后，屏幕显示如下：
图中的D、J、R、I、O、1、2代表可选择的选项，键入这些字母，程序的条件就会发生改变。D选项无须改变。J选项有三种条件可以选择，分别是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstraping法对进化树进行评估，所谓Bootstraping法就是从整个序列的碱基（氨基酸）中任意选取一半，剩下的一半序列随机补齐组成一个新的序列。这样，一个序列就可以变成了许多序列。一个多序列组也就可以变成许多个多序列组。根据某种算法（最大简约性法、最大可能性法、除权配对法或邻位相连法）每个多序列组都可以生成一个进化树。将生成的许多进化树进行比较，按照多数规则（majority-rule）我们就会得到一个最“逼真”的进化树。Jackknife则是另外一种随机选取序列的方法。它与Bootstrap法的区别是不将剩下的一半序列补齐，只生成一个缩短了一半的新序列。Permute是另外一种取样方法，其目的与Bootstrap和Jackknife法不同。R选项让使用者输入republicate的数目。所谓republicate就是用Bootstrap法生成的一个多序列组。根据多序列中所含的序列的数目的不同可以选取不同的republicate。当我们设置好条件后，键入Y按回车。得到一个文件outfile。（提示：在此最好把outfile更名为outfile1，因为后面步骤生成的文件都为outfile，可以一次更名为outfile1、outfile2….outfileN）
Outfile用记事本打开如下：
这个文件包括了100个republicate。
2、打开DNAPARS（最大简约性法）或DNAML（最大可能性法）软件。将刚才生成的outfile1文件输入。如下图：
选项O是让使用者设定一个序列作为outgroup。一般选择一个亲缘关系与所分析序列组很接近的序列作为outgroup（本例子不选outgroup），outgroup选择的好坏将直接影响到最后的进化树的好坏。选项M是输入刚才设置的republicate的数目。设置好条件后，键入Y按回车。生成两个文件outfile和treefile（立刻更名为outfile2和treefile1）。Outfile2打开如下图：
该文件包括了227个进化树。Treefile1可以用TREEVIEW软件打开同样包含了这227个进化树。
3、打开CONSENSE软件，将刚才生成的treefile1文件输入。如下图：
键入Y按回车。生成两个文件outfile和treefile（立刻更名为outfile3和treefile2）。Treefile2用TREEVIEW打开，如下
图：
Outfile3打开如下图：
我们看出两个树是同样的。但在outfile的树上的数字表示该枝条的Bootstrap支持率（除以100.6）。到现在，8个序列的进化树分析（最大简约法）已经完成。
bootstrap 软件
如果要用邻位相连法对这8个序列进行分析的话，也首先执行SEQBOOT软件将这8个序列变成100个republicate。然后，打开DNADIST软件，把SEQBOOT生成的文件输入，如下图：
选项D有四种距离模式可以选择，分别是Kimura 2-parameter、Jin/Nei、Maximum-likelihood和Jukes-Cantor。选项T一般键入一个15-30之间的数字。选项M键入100。运行后生成文件如下图：
这个文件包含了与输入文件相同的100个republicate，只不过每个republicate是以两两序列的进化距离来表示。文件中的每个republicate都省略了第一排的Mo3 Mo5  Mo6  Mo7  Mo8  Mo9  Mo12  Mo13。以这个输出文件为输入文件，执行NEIGHBOR软件。如下图：

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