AKTA avant操作步骤
                  2020年03月01日   胡凡
1 实验前准备
过膜的超纯水
过膜的20%乙醇
过膜的0.5M NaOH
过膜的样品
剪好的1.5mL EP管
1mL、2mL、5mL注射器
2 多肽的纯化
2.1开机
打开仪器开关；
打开电脑，等待几分钟后，仪器界面显示Ready；
打开软件，avant1的密码：defaultss，avant2、3、4的密码：default；
在System control模块中点击，弹出Connect to System对话框，default前勾选，点OK，仪器和电脑联机
2.2内置收集器的准备
注：齿轮条码向外放置（System control模块→View→ Fraction collector content）
2.3水洗泵和管路
先水洗：将入口管A1和B1浸入超纯水中→System control模块→Manual→弹出Manual instructions → Pump and pressure→ Pump wash→ Inlet A：A1；Inlet B：B1；Buffer Pro/Q inlet：off；Sample inlet：off(红字表示此处无需特别去设置，为系统默认) → Insert→ Execute→此步目的是置换管路中的20%乙醇→水洗平衡10min（没有固定时间，基
本上冲到UV_280和cond线平衡了，就可以停止了）后，手动停止；
B液洗B管路：水洗了之后，还要再用B液洗去B1管路中的水，因此将入口管B1浸入B液中，A1管仍放置在水中→System control模块→Manual→弹出Manual instructions → Pump and pressure→ Pump wash→ Inlet A：A1；Inlet B：B1→ Insert→ Execute→置换B1管路中的水→平衡到UV_280和cond线平衡，手动停止。注意，凝胶柱只需要一种缓冲液，B管路就不需要管，不需要水洗，不需要缓冲液洗，只洗A管路。（为什么要提前用B液洗B管路？因为用水泵洗之后，B管路是充满水的，而不是B缓冲液，此步若不洗，后面洗脱时才用到的B管路就是先拿水洗，这即损坏平衡状态，还影响实际的洗脱百分比参数）
2.4 层析柱的准备与连接（这步习惯称为五个参数！每个柱子不一样，记得查看）
System control模块→Manual→ Manual instructions
→Alarms→ Alarm pre-pressure：5.0 MPa→ Insert
→Alarms→ Alarm delta-pressure：1.8 MPa→ Insert
→Pump and pressure → system flow：1mL/min→ Insert
→Flow path→ Column position→ Position：position 3.→ Insert
→Flow path→ Inlet A→ Position：A→ Insert→ Execute
连接柱子：待管路中气泡排出→A口与柱子上端连接→水从柱子下端流出后，与排气泡后的B口相连）
2.5 编辑方法
Method Editor模块→File→ New Method→弹出New Method界面→Predefined Method→ Gel Filtration（凝胶层析）→OK
Method settings → Column type: Superdex Peptide 10/300GL→ Column position: Position 3→Flow rate：1mL/min→ UV：220 nm（蛋白吸收峰是280nm，多肽不一样？）
Equilibration（层析柱）→ Flow rate: 1mL/min → Equilibrate until：the total volume is 2 CV
Sample Application（上样）→ Flow rate: 1mL/min → Inject sample from loop→ Fill loop using: Manual load→ Loop type: Capillary loop→ Empty loop with: 4 mL
→ Fractionate→ in waste (do not collect)（第一次纯化的话，最好都收集）
Column Wash（去除结合的非特异性肽）→ Wash until the total volume is 2 CV
→ Fractionate→ in waste (do not collect)
Elution（洗脱目标物）→ Flow rate：1mL/min → Gradient elution→ Linear→ Target B 100%→length：2 CV （洗脱两倍柱体积可能有点少，凝胶柱2CV够了，其他流速快或者柱体积小的5-7CV合适。）
→ Fraction type: Peak fractionation→ Peak Fractionation destination:3mL tubes（Peak Fractionation settings：Mode: Level；Start level:50mAu, End level:50mAu, Column default:0.75min）→ Peak fractionation volume: 1mL
Column Wash（洗脱液）→ Wash until the total volume is 2 CV
editor版本→ Fractionate→ in waste (do not collect)
Equilibration（结合缓冲液A）→ Equilibrate until：the total volume is 2 CV
方法确定无误后，File→ Save或Save As保存
2.6 放入收集器
确保柱子已经平衡好，在仪器为Ready的状态，将收集管架放入收集器内，通过View- Fraction collection content查看收集管架是否识别
2.7 手动上样并运行方法
将2mL上样环与loop E和loop F相连（1 ml柱子的时候）；
采用注射器与鲁尔接口相连，大于2mL超纯水（体积至少大于上样环两倍体积）清洗上样环（注：水中不可有气泡）；
将排除气泡的样品用注射器注入上样环中（注：不可有气泡，直到上样结束之后，注射器不可拔出，否则会有气泡）；
运行方法：System control模块→点击，到自己保存的方法，双击打开→运行实验方法
3关机
3.1 水洗（不同柱子洗柱方法不一样，此处为阴离子交换柱）
将入口管A1浸入超纯水中设置五个参数（接柱子那样设置五个参数！）→ Execute→清洗柱子至平衡，暂停，A1插入氢氧化钠中，再继续冲洗至平衡，换水冲至平衡，再换20%乙醇冲至平衡。调低五个参数中的流速，下柱子。
3.2洗管路
pump wash，用水和乙醇各冲一遍管路
4数据处理
Evaluation模块→ 双击打开数据→鼠标右键，选择Customize，将要显示测线勾选，导出图，关机器。

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