医学免疫学实验指导：沉淀反应
【内容】
六、环状沉淀试验
七、单向免疫扩散试验
八、双向免疫扩散试验
九、对流免疫电泳试验
十、火箭免疫电泳试验
十一、免疫电泳试验
可溶性抗原（如毒素、血清蛋白、细胞碎片）与相应抗体特异性结合，在两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。可溶性抗原与相应抗体相比，抗原分子小，故抗原的反应面积大，为使抗原抗体比例适当，一般应稀释抗原。
试验 、环状沉淀试验
（Ring precipitation test）
将高浓度的抗血清置于直径较小的环状沉淀管中，再缓缓加入血清，使二者间有一清晰界面。如抗原抗体相对应，一段时间后，在液面交界处可形成白沉淀环。
此试验常用于抗原的定性试验，如诊断的Ascoli试验、鉴定血迹、测定媒介昆虫的嗜血习性等。
【材料】
1、兔抗人血清、人血清、牛血清、生理盐水。
2、毛细吸管、环状沉淀管及环状沉淀管架。
【方法】
1、取环状沉淀管三支置于环状沉淀管架上，做好标记。用毛细吸管加入兔抗人血清各0.2ml于管底。
2、用毛细吸管分别吸取人血清、牛血清、生理盐水0.2ml，沿试管壁缓缓加入三支沉淀管，使两层液体之间有一明显的交界面。
3、室温下静置10~20分钟，观察结果。
【结果】
观察各管两层液体交界面有无白沉淀环出现，有白沉淀环的为阳性。（图4—5）
【注意事项】
加下层兔抗人血清时应注意将毛细吸管管口置于沉淀管底，避免气泡产生；加上层液体时毛细吸管不能接触到下层液体，吸管口靠在沉淀管壁上缓缓加入，否则不能形成清晰界面。
试验 、单向免疫扩散试验
（Single immunodiffusion test）
此试验属定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中先将某种已知抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将需检测的一定量的抗原加入孔中。在反应过程中，抗体已经均匀分布在琼脂板中，只有抗原向四周呈辐射状扩散，故称为单向免疫扩散试验。如果抗原抗体相对应，则在比例适当的地方出现一白的沉淀环。沉淀环的直径大小与抗原的浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗体反应后测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原的浓度作为横坐标可绘制标准曲线图。测出待侧抗原在相同条件下的沉淀环直径，即可从标准曲线中求出其含量。此试验主要用于检测血清中各种Ig和补体成分的含量。
【材料】
1、标准参考血清：冻干正常人混合血清，其中IgG含量为经标准标定的已知量，用以制作标准曲线。
2、IgG诊断血清。
3、待检标本：人血清。
4、1.5%琼脂盐水、PBS、载玻片、直径3mm打孔器、微量加样器、湿盒、半对数坐标纸。
【方法】
1、免疫琼脂板的制备：将适宜浓度的诊断血清与预先溶化好的并保存于56℃37度水浴箱中保温的1.5%琼脂盐水按一定比例混合后，立即浇注在载玻片上，每块3.5ml（厚度2mm），置室温冷却凝固制成免疫琼脂板。
2、打孔：用直径3mm打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为15mm，孔内琼脂用打孔器的针尖挑出。
3、加样：取冻干参考血清一支，加入0.5ml蒸馏水溶解，用0.01mol/L  pH7.2~7.4PBS倍比
稀释成1:10~1:160五种浓度。用微量加样器分别取10μl不同浓度的参考血清准确加入免疫板的孔内，每一浓度加2个孔，然后用同样的方法取10μl事先用PBS1:40稀释的待检血清加入孔内，每份标本加2个孔。
4、反应：将加样的琼脂板置湿盒内，放37℃恒温箱24—48小时后取出，测量各孔沉淀环直径并作记录。（图4—6）
【结果】
以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸
上作图，绘制标准曲线。根据待检血清的沉淀环直径，从图上可查出IgG浓度。查得的浓度乘以标本的稀释倍数即可得该标本IgG的浓度（图4—7）
【注意事项】
1、制备琼脂板时温度不宜太高以免抗体变性失活，也不宜太低以免使琼脂凝固不匀。
2、制备琼脂板时，载玻片一定要置于水平位置。
3、孔要圆整、光滑，孔中琼脂不能与载玻片分离。
4、时间要适当。时间过短，沉淀线不能出现；时间过长，沉淀线解离或散开，影响结果判断。
5、测量沉淀环直径必须准确，以mm为测量单位。
6、
试验 、双向免疫扩散试验
（Double immunodiffusion test）
此法为定性试验。将抗原、抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，两者各自向四周扩散，在比例适当处形成可见的白沉淀线。如果所加抗原、抗体标本中有多对抗原抗体系统，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗原抗体。因此观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。
此试验常用于抗原和抗体的纯度鉴定，也可用已知的抗原（或抗体）检测未知的抗体（或抗原）。本试验以检测血清甲胎蛋白（AFP）为例。
【材料】
1、待检血清、AFP阳性血清。
2、AFP诊断血清。
3、1%琼脂盐水、载玻片、直径3mm打孔器、吸管等。
【方法】
1、琼脂板的制备：将载玻片置于水平台面上，用吸管吸取加热溶化的1%琼脂盐水3.5ml，均匀地浇注在载玻片上，注意勿产生气泡，琼脂厚度约为2mm。
2、打孔：待琼脂凝固后，用打孔器据图样（见图4-9）打孔，孔径3mm，孔间距5mm，挑出孔内琼脂。必要时将玻片底部在酒精灯火焰上略微加热，或在小孔内加入少量溶化的琼脂封闭孔底。
3、加样：用毛细细管于中央孔加入AFP诊断血清，周围1、4孔加入已知AFP阳性血清作为对照，2、3、5、6、孔分别加入待检血清。加样时以加满小孔为度，避免出现气泡和溢出孔外。
4、反应：将琼脂板放入湿盒内置37℃恒温箱中，24小时后取出观察结果。
【结果】
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1、4两孔（AFP阳性血清）与中央孔（抗AFP抗体）
之间应出现清晰的乳白沉淀线。其余各孔则根据与中央孔之间有无沉淀线及沉淀线的特征判断结果。如图4-9所示，2、6孔待检血清标本与中央孔产生沉淀线，并与相邻阳性对照所产生的沉淀线相融合，则表示阳性；3孔无沉淀线出现，5孔虽形成沉淀线，但与阳性对照沉淀线相交叉，表明为另一对抗原抗体反应，故3、5孔均为阴性。
【注意事项】
1、加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形状。
2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉淀线不出现或不清楚。
3、加样时抗体、阳性血清及每份待检标本应各用一支吸管，以免混淆，影响试验结果。
试验 、对流免疫电泳试验
（Counter immunoelectrophoresis test）
对流免疫电泳是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。将琼脂板置于电场中，在pH8.6
的缓冲液中，大多数蛋白质抗原带负电荷向正极移动，而抗体为球蛋白，由于暴露的极性基团少，所带负电荷低，且分子量较大，移动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极移动（电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的液体带正电荷，因此液体向负极移动，产生电渗）。这样抗原抗体相向运动，在比例适当处形成乳白沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向移动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短了反应时间。此试验常用于检测甲胎蛋白（AFP）、乙肝病毒表面抗原（HBSAg）。
【材料】
1、HBSAg阳性血清、待检血清、抗HBSAg血清。
2、钠—盐酸缓冲液（0.05mol/L，pH8.6）、1%离子琼脂（用缓冲液配置）。
3、载玻片、直径3mm打孔器、毛细吸管、电泳仪、滤纸片等。
【方法】
1、琼脂板的制备：将已制备好的离子琼脂在水浴中加热溶化，用吸管吸取3.5ml浇注在玻片上，冷凝后备用。
2、用打孔器按模型打成双排孔，孔径3mm，孔间距4mm，行间距4mm。
3、加样：用毛细吸管在双排孔的一侧加入抗HBSAg血清，另一侧分别加入HBSAg阳性血清和待检血清，注意抗原抗体的位置要一致。加样时以加满小孔为度，注意不能让液体溢出。
        －                                        ＋
                  Ag      Ab    Ag        Ab
4、电泳：将加好样的琼脂板放置电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分别用双层滤纸片与电泳槽中的pH8.6的钠缓冲液相连，接通电源，调节电流为2—4mA/cm板宽或电压为4—6V/cm板长，电泳45—60分钟。
5、电泳毕，关掉电源，取出琼脂板，观察在相应抗原抗体孔间有无白沉淀线出现。
【结果】
阳性对照孔与抗血清孔间出现清晰白沉淀线。若待检血清与抗血清孔间出现沉淀线为阳性，反之无沉淀线为阴性。若沉淀线不够清晰，可在37℃下放置数小时，以增强沉淀线清晰度。
【注意事项】
1、对流免疫电泳试验的灵敏度较双向免疫扩散试验高，但由于电泳时缓冲液的离子强度、pH值、端电压和电泳时间等因素的影响，有时可能出现假阳性反应。
2、抗原与抗体量应相接近，如抗原量过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。
试验 、火箭免疫电泳试验
（Rocket immunoelectrophoresis）
火箭免疫电泳是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。将抗体溶入琼脂后制板，在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。峰的高度与抗原浓度呈正相关。（见图4—11）当琼脂中的抗体浓度固定时，以不同浓度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待侧抗原的含量。反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待检抗体的含量（即反向火箭免疫电泳试验）。本试验以检测甲胎蛋白为例。

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