丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)酶学性质研究
左爱连，张伟国，高伟
江南大学工业技术教育部重点实验室，江苏无锡（214122）
E-mail：zhangwg168@126
摘要：本文初步对丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的酶学性质进行研究。通过单因素考察，确定了酶反应底物溶液中用于细胞破壁破碎的CTAB以及辅酶磷酸吡哆醛(PLP)的最佳添加量分别为0.03 g/L和30 µmol/L。测定出SHMT酶活最高时的最适温度为30 ℃，最适pH为8.0，在研究中发现甲基营养型的菌株的SHMT活性比原始出发菌高出许多，而且在产量越高的菌株中SHMT的活性越高。
关键词：L-丝氨酸，丝氨酸羟甲基转移酶，酶学性质
丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶，能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化，具体的催化反应如下[1]：
SHMT
甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸+四氢叶酸
在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）作用下，甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸，它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关，但由于SHMT的催化作用理论上是双向的，有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。本文考察了各种营养因子对SHMT的酶活的影响，可以以此作为参考来指导菌株的选育和发酵条件的优化。因此考察SHMT活性对于L-丝氨酸产量的影响是非常有必要的。
1  材料和方法
1.1 实验菌株
菌株A3、U-16、JW-01、JW-01-108和LJW-01（本实验室提供）。
1.2 种子培养基（g/L）
甘氨酸 10，(NH4)2SO4 15，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.3，玉米浆15。以200g/L NaOH 调pH7.0～7.2，0.1 Mpa压力下灭菌20min。
1.3 发酵培养基（g/L）
葡萄糖50，甘氨酸20，(NH4)2SO4 2，NH4NO3 3，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，生物素0.2 mg/L，硫胺素1 mg/L，核黄素2 mg/L，叶酸1 mg/L，泛酸钙1 mg/L，烟碱1 mg/L，吡哆醇1 mg/L，CaCO3 25。以200g/L NaOH调pH8.0～8.2，0.07 Mpa压力下灭菌7min。
1.4 实验用菌的培养[2]
菌株在种子培养基中生长10 h后，取适量种子液，9600 r/min离心10 min，弃去上清液，将菌体用磷酸缓冲液震荡洗涤后在9600 r/min下离心10 min，弃去上清液，再重复一次所得菌体即为实验用湿菌。
1.5 SHMT逆向酶活的原理及定义[3,4]
SHMT可以水解DL-苯基丝氨酸生成甘氨酸和苯甲醛，后者在279 nm处有特征性的强烈吸收。按1mg湿菌体/ 1mL底物溶液（50 mmol/L DL-苯基丝氨酸，30 µmol/L磷酸吡哆醛）制备反应液，反应液按一定的比例加入0.03g/L十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）处理菌体，30℃震荡反应1 h，以5000 r/min离心10min，取上清，测定A279值，根据A279-苯甲醛浓度回归方程确定反应液中苯甲醛浓度。
30 ℃在1 L底物溶液中，1 g湿菌体反应1 h产生1 mol苯甲醛定义为1个酶活单位。
1.6 苯甲醛标准曲线的绘制
于黑暗通风处取l µL苯甲醛加至10 mL水中充分溶解后，梯度稀释并于279nm处测定吸光度，重复三次取平均值计算出A279-苯甲醛标准曲线回归方程。reaction研究
2 结果和讨论
2.1 甘氨酸和丝氨酸之间的相互转化[5]
甘氨酸和丝氨酸之间的相互转化已有许多报道[6-7]。丝氨酸是由甘氨酸转化而来，但是丝氨酸并没有反向转化成甘氨酸，由表1可以看出发酵培养基中添加的L-丝氨酸没有被消耗。这表明丝氨酸转化成甘氨酸需要特殊的转化条件或者本实验室保藏的菌株根本没有反向转化的能力。
表1 甘氨酸和丝氨酸的相互转化
Table1 Interconversion of glycine and L-serine
甘氨酸或丝氨酸的添加量（g/L）菌体密度
OD562
L-丝氨酸
(mg/mL)
残留甘氨酸
(mg/mL)
甘氨酸
(mg/mL)
残留L-丝氨酸
(mg/mL)
10 0.64    3.1    1.7 - -
20 0.70    5.2    5.0 - -
30 0.66    5.7 16.9 - -
甘氨酸
40 0.71    5.4 27.4 - -
10 0.55 - - 0 7.3
20 0.61 - - 0 16.3 L-丝氨酸
40 0.53 - - 0 38.7 注：以发酵培养基作为生产丝氨酸的基础培养基，另外添加甘氨酸或L-丝氨酸，30℃，72h，100r/min。2.2 苯甲醛标准曲线
重复三次测定苯甲醛的吸光度的平均值如表2所示。标准曲线如图1所示。
表2  苯甲醛在279nm的吸光度
Table2 Absorbance of Benzaldhyde at 279nm
苯甲醛浓度（mmol/L）0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 A279-1 0.1040.197 0.193 0.389 0.579 0.958
A279-2 0.0990.197 0.295 0.396 0.586 0.974
A279-3 0.1210.198 0.328 0.381 0.563 0.917 平均值A2790.1080.197 0.305 0.389 0.576 0.950
00.10.20.30.40.50.6
0.2
0.4
0.6
0.8
1
A 279值
苯甲醛浓度（m m o l /L ）
图1  苯甲醛标准曲线图
Fig.1  The standard curve of Benzaldhyde
2.3  表面活性剂CTAB 浓度对SHMT 酶活的影响
由于本实验所采用的菌种中SHMT 位于细胞内，在测定SHMT 酶活前需要先将细胞破壁。本实验采用了添加表面活性剂CTAB 的方法破碎细胞壁和细胞膜。分别考察了浓度为0.01 g/L 、0.02 g/L 、0.03 g/L 、0.04 g/L 、0.05 g/L 、0.06 g/L 和0.07 g/L 的CTAB 对酶活的影响，选择出SHMT 酶活最大时的CTAB 浓度作为酶活测定时底物溶液中的浓度结果见图2。
0.10.20.30.40.50.60.70.80.90.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
CTAB浓度（g/L）
S H M T 酶活（U ）
图2  CTAB 浓度对SHMT 酶活的影响
Fig.2  Effect of concentration of CTAB on SHMT activity
由图2可以看出在低浓度CTAB 存在时细胞未能充分破壁，酶活相对较低。当CTAB 浓度为0.03g/L 时酶
活达到最大，而当CTAB 浓度较高(大于0.05g/L)时酶活受到CTAB 的影响，有一定的下降。因此底物溶液中CTAB 浓度选择为0.03g/L ，作为细胞破壁的最佳浓度。
2.4  pH 对酶活的影响[8]
溶液的pH 对反应速度有很大的影响，原因是多方面的。酶活性中心的必须基团一般是带电荷的氨基酸侧链基团，只有在特定的解离状态才能结合底物和催化底物反应，pH 直接
影响了这些基团的解离状态，从而改变了反应速度即改变了酶的活性。而过高或者过低的pH 可以影响酶蛋白的构象，甚至变性失活。pH 还直接影响底物分子的解离状态，从而影响底物分子和酶的结合而影响反应速度。本实验考察了30℃下，CTAB 浓度为0.03 g/L ，pH 分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0时菌株LJW-01的酶活，测定结果见图3。
00.2
0.4
0.6
0.81
4
5
6
7
8
9
pH
S H M T 酶活（U ）
图3  pH 对SHMT 酶活的影响 Fig. 3  Effect of pH on SHMT activity
由图3可以看出在酸性较强的条件下SHMT 活性受到抑制，而在pH 为8.0时酶活达到最大，而在更高的pH 下酶活并没有大幅的减少。因此选定pH 8.0为底物溶液的pH 。
2.5  温度对酶活的影响
温度对酶活性的影响有两方面。一方面是温度上升使底物能量增加，分子碰撞概率增加，从而使反应速度加快；另一方面，随着温度上升超过某一界限，酶蛋白逐步变性，导致有活性的酶减少而体现为酶活的下降。酶反应的最适温度就是这两种效应平衡的结果。本实验考察了15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和60℃下SHMT 的酶活，在pH 为8.0、CTAB 浓度为0.03 g/L 时测得。具体结果见图4。
0.10.20.30.40.50.60.70.80.9115
20
25
30
3540
45
50
60
温度（℃）
S H M T 酶活（U ）
图4  温度对SHMT 酶活的影响 Fig. 4  Effect of temperature on SHMT activity
图4表明该菌在一定的温度范围（15℃～30℃）内酶活随温度的升高而增高，最适反应温度为30℃左右。温度升高到40℃以上，由于酶蛋白会发生变性，酶活急剧下降。
2.6  磷酸吡哆醛（PLP ）浓度对酶活的影响
磷酸吡哆醛作为SHMT 的辅酶，对于整个催化反应具有非常重要的作用，因此必须对磷酸吡哆醛的浓度和SHMT 的酶活的关系考察，以出最佳的磷酸吡哆醛的添加浓度。在30℃、pH8.0、CTAB 添加浓度0.03g/L 下，分别测定PLP 浓度为10µmol/L 、20µmol/L 、30 µmol/L 、40µmol/L 、50µmol/L 、60µmol/L 、70µmol/L 和80µmol/L 时的酶活，结果见图5。
0.10.20.30.40.50.60.70.80.910
20
30
40
50
60
70
80
PLP浓度（μmol/L）
S H M T 酶活（U ）
图5  PLP 浓度对SHMT 酶活的影响
Fig. 5  Effect of PLP concentration on SHMT activity
由图5可看出，在底物溶液中含有较低浓度PLP 时，酶的活性随着PLP 浓度的加大快速提高，而当溶液中PLP 达到30µmol/L 时酶的活性达到最大。当溶液中的PLP 浓度继续增大时，SHMT 的酶活并没有提高。当菌体湿重与PLP 添加的比例为1mg:0.03µmol 时，菌体中SHMT 所需的PLP 的量已经得到满足。选定30 µmol/L 作为底物溶液的最佳PLP 浓度。
2.7  SHMT 活性对L-丝氨酸产量的影响
本实验考察了初始出发菌株A3（Gly R , L-丝氨酸产量为3.1g/L ），菌株U-16(甲基营养型，L-丝氨酸产量为3.1g/L)，菌株JW-01（Gly HR , Mth R , 甲基营养型，L-丝氨酸产量为4.4g/L ），菌株JW-01-108（D-Ser R , Gly hR , Mth R , 甲基营养型, L-丝氨酸产量为5.3g/L ）以及菌株LJW-01（Met -, SG R , D-Ser R , Gly HR , Mth R , 甲基营养型, L-丝氨酸产量为6.2g/L ）。五者的SHMT 活性，希望能够到SHMT 酶活与L-丝氨酸产量之间的关系。
在温度为30℃、pH8.0下分别测定五株菌的SHMT 活性，结果见图6。
0.2
0.4
0.6
0.8
1
A3
U-16
JW-01JW-01-108
LJW-01
菌株
酶活(U )
图6  不同菌株的SHMT 酶的活性 Fig. 6  SHMT activity of different strains
由图6可以看出甲基营养型的菌株U-16虽然和菌株A3的L-丝氨酸产量相同，但是SHMT 活性比A3高出许多，而且在产量越高的菌株中SHMT 的酶活性越高，根据前面所做的甘氨酸和丝氨酸转化实验，可以理解为SHMT 的酶活性越高，菌株L-丝氨酸的产量或者潜在产量越高，因此在几株产量相近的菌株选择一株作为出发菌时，可以分别测定各菌株的SHMT 酶活，结合产量选择出最佳的菌株。
3  结论
（1）SHMT 酶的最适温度为30℃；最适pH 为8.0；CTAB 添加浓度为0.03 g/L 时细胞破壁效果最好，酶活达到最高；PLP 的添加浓度为30 µmol/L 时酶的活性达到最大。 （2）丝氨酸是由甘氨酸转化来的，但是在相同的培养条件下，本实验所用菌株不能将丝氨酸反向转化成甘氨酸。
（3）甲基营养型的菌株SHMT 活性比原始出发菌高出许多，而且在产量越高的菌株中SHMT 的活性越高。
参考文献
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