生物标志物的筛查方法及研究进展
虞萌;黄家恺;巴俊强;蒋成燕
【摘 要】生物标志物在疾病的预测、诊断、病情监测、效果和预后评估及疾病普查等方面有很大的价值.寻疾病相关的生物标志物已成为热点话题,尤其在肿瘤领域.基因组学、蛋白质组学及代谢组学研究的日趋深入及相关技术的合理应用,将会对筛选理想的特异性生物标志物提供有益的方法.基因组学从分子生物学技术水平分析疾病状态下基因顺序、数目、排列等的变化,出可能致病的差异基因,随着遗传工程技术日趋成熟,基因水平寻生物标志物已被广泛报道.蛋白质组学技术多样化有利于筛选区别于生理状态下的差异表达蛋白质(潜在生物标志物),有利于阐明疾病的发病机制,对疾病的预防、诊断、预后具有重要作用.随着核磁共振技术和质谱等技术的发展,代谢组学已广泛应用于疾病的诊断、分子生理学、分子病理学及基因功能组学等多领域.后基因组时代蛋白质组学及代谢组学作为新兴学科不断被重视.%Biomarkers have great value in predicting ,diagnosis,monitoring, treatment,prognosis and general investiga-tion of diseases .Looking for disease-related biomarkers has become a popular topic ,especially in the field of oncology .The rational application of genomics ,proteomics,me
tabolomics and related technologies will provide a useful method for screen -ing specific biomarkers.Genomics analyzes the sequence ,number,arrangement of genes by molecular biologic technology to find out the different genes that may cause diseases .With the development of genetic engineering technology ,the search of biomarkers on gene level has been widely reported .The diversification of proteomics technology is helpful to screen differen-tially expressed proteins ( potential biomarkers ) different from physiological condition ,and is helpful to elucidate the patho-genesis of diseases and plays an important role in disease prevention , diagnosis and prognosis .With the development of nuclear magnetic resonance and mass spectrometry , metabonomics has been widely used in the fields of diagnosis ,molecular physiology , molecular pathology and functional genomics .The post-genomic era ( proteomics ) and metabolomics are more and more valued as emerging disciplines .
【期刊名称】《医学综述》
【年(卷),期】2017(023)005
【总页数】5页(P867-871)
【关键词】生物标志物;基因组学;蛋白质组学;代谢组学
【作 者】虞萌;黄家恺;巴俊强;蒋成燕
【作者单位】遵义市第一人民医院内分泌科,贵州 遵义 563000;遵义市第一人民医院骨科,贵州 遵义 563000;遵义市第一人民医院内分泌科,贵州 遵义 563000;遵义市第一人民医院内分泌科,贵州 遵义 563000
【正文语种】中 文
【中图分类】R446
生物标志物是能被客观测量的指标，可作为正常生物学过程、病理改变、后的药物反应的指标。根据信息采集形式不同生物标志物主要分为3种类型[1-2]：活检组织样本中检测到的生物化学或组织学指标；血液或体液样本中检测的生化指标或细胞；影像学检查发现的解剖、功能或分子指标。随着分子生物学理论及技术不断被发明及利用，疾病发生、发展的分
子机制逐渐明朗化，多种因素引起的基因、组织发生变化，进而表达、合成某种细胞、蛋白质等活性物质，分泌到组织或体液中，在体液或组织中含量升高，并被多种技术研究检测、发现[1]。早期临床常用影像学手段及组织病理学检查来初步判断某种疾病的状态，继以基因组学、蛋白组学、代谢组学不断被引用并补充，使越来越多的生物标志物的发现成为可能。现从基因组学、蛋白质组学、代谢组学3个方面简要概括近几年国内外文献筛选生物标志物的方法及进展。
随着分子生物学、生物信息学和遗传学研究的不断深入及基因组计划的完成，基因组学研究亦得到飞速发展，被应用于诸多领域。从基因水平而言，肿瘤的发生、发展是包含多基因综合变化的过程，包括基因突变、核酸分子甲基化、短串联重复序列不稳定及端粒酶生物活性改变等分子事件的发生，最终导致细胞恶变[1]。因此，发现这些分子事件对肿瘤筛检有突破性的意义。常见的肿瘤标志物筛检方法包括DNA甲基化、线粒体DNA突变、端粒酶活性及热点应用的基因芯片技术。
1.1 基因水平肿瘤标志物的筛选
1.1.1 DNA甲基化检测 DNA甲基化水平改变可引起基因功能异常，甲基化状态过低或过高均
可能导致细胞癌变，作用机制尚不清楚，但异常甲基化检测方法的更新、推广及应用使利用肿瘤相关基因异常甲基化预判早期肿瘤发生的研究成为热点。部分肿瘤相关甲基化标志物可取材于唾液、尿液等体液标本，因取材方便、简单且无创，该方法成为某些肿瘤筛检的重要方法[2]。Galectin 7主要由DNA甲基化表达产生，对预测胃癌的发生有重要的意义[3-4]。
1.1.2 线粒体DNA突变检测 线粒体DNA突变测定很大程度依赖于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，以PCR技术为基础的分子检测方法不断改进，可检测血清中微量差异游离核酸。通过对不同疾病状态与正常对照人线粒体DNA进行测序比对，发现基因突变位点，结合PCR，筛选差异核酸。线粒体DNA突变可造成线粒体结构形态、功能发生异常，由此导致以神经肌肉系统为主的多系统疾病[5]。
1.1.3 端粒酶生物活性检测 端粒在染质自我复制、保护及细胞生长调控几个方面发挥重要作用，与细胞转化及永生性密切相关，端粒长度是由端粒酶生物活性所决定的，肿瘤细胞永久性生存能力与端粒酶生物活性高度相关[6]。毛细管凝胶电泳技术、免疫荧光标记技术的应用，使端粒酶检测变得高通量且自动化。1994年利用PCR技术建立了端粒酶活性检测技术，推动了端粒酶与肿瘤的研究，端粒酶通过使抑癌基因失活促进细胞恶化[6]。
1.1.4 基因芯片技术 基因芯片作为20世纪90年代盛行的高度集成化的分析和研究手段，广受青睐，样品基因组核酸经体外转录，通过PCR扩增，掺入标志分子后，与基因芯片上的已知序列杂交，荧光检测系统对基因芯片，扫描并检测杂交信号强弱，根据信号强度数据比对及综合分析，可获得样品中大量的基因序列及基因异常表达信息[7]，在DNA测序、基因诊断等领域应用广泛。董亚辉和宋展[8]利用基因芯片技术筛选原发性肝癌不同阶段差异基因，提出差异基因与恶性肿瘤存在关联。
1.2 基因组学应用存在的问题 运用基因组学技术筛查出许多可能成为肿瘤标志物的相关基因，基因组学使某些肿瘤早期诊断成为可能。但基因检测仍存在许多困难，如多数基因检测仍要求组织活检，限制了基因检测的应用[1]。再者诸多分子序列就目前检测水平尚不能明确其确切的基因序列，制作分子探针时比较困难，许多标志物尚处于初级研究阶段，需要投入更多资源，探索更多技术才能走向早期筛查、预测及临床诊断这一步。
reaction研究蛋白质组学意指一种基因组所表达的全套蛋白质，翻译及转录后的修饰及剪辑过程极其复杂，降低了信使RNA(mRNA)水平与蛋白质水平的关联性，单纯的基因改变并不能反映机体整体功能的复杂性[9]。蛋白质作为基因表达的最终产物，充当生命活动的执行者，直接反映
了机体生命的复杂和多变性。因此，只有对执行者蛋白质进行分析，才能更好地解释细胞活动或其行使功能的过程，才能更贴近生命现象的本质。由此蛋白质组学成为一个热门的研究领域，可在生物医学应用中用于比较组织或器官在不同疾病状态下蛋白质的表达差异，筛选出差异蛋白质，进而运用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunesorbent assay，ELISA)或Western Blot对差异蛋白质进行验证，从而到疾病或状态相关的蛋白质作为生物标志物，为区分疾病状态及完善个体化提供新靶点及途径[10]。差异蛋白质筛选成为寻生物标志物的核心手段，以下介绍几种临床蛋白组学研究中筛选差异蛋白质的常见技术及其优缺点。
2.1凝胶技术
2.1.1 双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE) O′Farrell[11]首次提出2-DE，2-DE技术是根据蛋白质的带电性和分子量大小的不同，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质组的技术，2-DE技术因其高灵敏度、高分辨率，便于图像分析处理，易与质谱分析(质谱法是一种通过样品离子的质荷比不同来测定来并分析的方法)等鉴定方法相适应并结合等优点成为传统蛋白质组学研究的及其重要的手段[12]。简略研究流程：①蛋白混合物样品二维
凝胶电泳、染；②扫描获取染凝胶上的蛋白图像，量化蛋白斑点信息，得出两组差异表达的蛋白质点并酶切；③质谱仪分析获得蛋白质点的肽质量指纹图，并在蛋白质序列数据库中搜索匹配蛋白质，确定各点所对应的蛋白质；④Western Blot或ELISA对差异蛋白定量分析。
Jiang等[13]应用2-DE结合质谱分析及Western Blot验证，提出脱氧鸟苷三磷酸酶和β2-糖蛋白可能与妊娠期唐氏综合征相关，有望作为妊娠期唐氏综合征产前筛查的生物标志物。2-DE方法可以直观看到差异表达蛋白，但其对低丰度蛋白和非极性蛋白分辨率不够，难于鉴定[14]。且2-DE技术在样品制备、电泳条件和凝胶染等条件上不能完全一致，凝胶间差异难以避免，实验重复性差，敏感性低，易产生假阳性[15]。
2.1.2 二维差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE) 为解决2-DE技术存在的缺陷，荧光2D-DIGE技术被提出，与传统2-DE 相比，敏感性、精确性及分辨率更高[16]，该技术是建立在传统的双向电泳技术的基础上，先对蛋白样品进行荧光标记，然后行电泳，再将标记好的蛋白质样品进行混合，在一块凝胶上电泳，荧光显微镜下，用不同的激发波长来检测电泳结果[17]。Liu等[18]应用2D-DIGE结合质谱分析比较手足口病
儿童及健康儿童血清样品，得出15种差异蛋白，经ELISA验证后提出血清淀粉样蛋白A可能成为手足口病临床诊断的生物标志物。2D-DIGE技术可以全面地观察到两种样品蛋白质组间表达差异，避免了由于在不同凝胶上电泳对结果分析带来的差异，确保试验条件一致，对差异蛋白质表达点的筛选更有说服力。观察同一蛋白质点不同波长扫描下荧光密度的不同，获得特定蛋白质点丰度的差异，判定蛋白质是否缺失或是否有新蛋白质出现等信息[12]。但是2D-DIGE与质谱的联用实施困难，不易自动化，存在偏向性问题，对于相对分子质量过大或过小的蛋白质、低丰度蛋白质或疏水性蛋白质难以进行分离解析[12]。
2.2 质谱技术 质谱仪及相关技术的迅速发展，将蛋白质组分析研究推向了一个新的高度，高分辨率的蛋白质/肽段的分离及质谱分析工具克服了2D-DIGE的困难，能够精确地分离解析分子质量过大或过小的蛋白质、低丰度蛋白质、疏水性蛋白质[19]。目前应用的质谱法有许多种，其中3种方法被广泛应用。

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