自动化定量检测梅毒的研究进展
  摘要： 梅毒是由梅毒密螺旋体感染引起的。传统检测梅毒的方法需要熟练的技术员操作和解释结果。最近的研究显示，自动化定量检测梅毒的方法正成为研究热点，将逐渐替代手工法，而自动化RPR检测特别适合于疗效监测。
        关键词：梅毒；密螺旋体实验；乳胶凝集；RPR
        目前，在临床实验室常用的梅毒检测方法一般需手工进行，肉眼或显微镜观察结果，容易误判，而且不能准确定量，很难量化疗效。国外已开始研究自动化检测梅毒的方法，自动化定量检测必将成为梅毒检测的发展趋势。另一方面，我国梅毒感染呈上升趋势【1-2】，甚至胎传梅毒感染也呈逐年上升趋势【3】，不仅关系到病人本身，还关系到我国出生人口素质，因此，需要尽快提高梅毒的检测手段，早期诊断，早期，更好为临床服务。
下面，本文就近年来自动化定量检测梅毒的研究进展做一综述。
一、传统梅毒检测方法----梅毒抗体检测【4】
（一）、特异性抗体检测。
        梅毒螺旋体的重要致病因子包括12种膜蛋白和几种溶血素，当人体感染梅毒螺旋体后，
大约经过3周的潜伏期，在入侵部位出现硬下疳，然后5-15天后可在血清中检测出梅毒特异性抗体。目前常用的有梅毒密螺旋体血凝试验（TPHA），梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA），酶联免疫吸附试验（ELISA），梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS），胶体金法，梅毒抗体蛋白印记法（Western-blot，WB）。
        检查特异性抗体的试验目标是在临床进行确诊，该类检测能很好诊断各期梅毒，结果稳定可靠，但价格相对较高且耗时长。其缺点是不适于大批量的筛选试验，无法对梅毒的疗效及预后进行判断，也无法确定梅毒是否已被治愈和再感染。
（二）、梅毒非特异性类脂质抗体检测。
        梅毒非特异类脂质抗体为梅毒螺旋体侵犯及损伤组织所产生，出现较晚，一般在硬下疳出现4周才能检出，在梅毒早期患者经充分后滴度可逐渐下降直至完全消失，当病情复发或再感染后可由阴性转阳或滴度逐渐上升。目前常用的方法有：性病研究实验室试验（VDRL），血清不需加热的反应素试验（USR），快速血浆反应素环状卡片实验（RPR）和甲苯胺红不加热血清反应素试验（TRUST）。
        此类试验价格便宜、手工进行，其中RPR是观察效果、复发、或再感染的重要指标。但此类试验要由肉眼或显微镜观察结果，其缺点是费人费时费力，不适合有大批量标本
的血站医院筛查；而且实验人为影响因素较多，容易误判；由于不能准确定量，很难量化疗效。
二、自动化检测梅毒的发展方向。
（一）、PCR（Polymerase chain reaction-based tests，聚合酶链反应试验）。
        用PCR方法检测梅毒的研究是从90年代就开始了【5】，但是费时费力，一直没有在临床得到推广。2013年，Gayet-Ageron A[6]系统分析了从1990年1月至2011年1月间用PCR方法诊断梅毒的报道，发现用PCR方法特异性好，但是灵敏度只有中等，对结果的影响因素很多，包括：一、不同的标本，会有不同的检出率。其中在初发梅毒的溃疡物中，PCR法检出率最高。PCR对血液中梅毒的检测不是很理想，血清和血浆中梅毒的检出率要高于全血中的检出率；二、选择的目标基因不同，如有的实验室选择tpp47，而有的则选择 polA gene，因而检出率也不同。；三、选择的PCR方法不同，如巢式PCR（Nested PCR）、实时定量PCR检测（real-time polymerase chain reaction）、多重PCR（Multiplex PCR）等，检出率也不同。
        2012年，Grange PA[7]结合临床表现，血清学检测，DEM（dark-field microscopy，暗视野显微镜），巢式PCR（扩增tpp47基因）等手段检测梅毒，发现用PCR检测拭子标本，
其灵敏度达82%，特异性达95%，与DFM结果的吻合率为0.53，但是血标本的PCR结果并不好，在外周血单核细胞，血浆，血清，全血中的灵敏度分别只有29%，18%，14.7%，24%。
总体说来，用PCR方法检测溃疡物和硬下疳，还是较好的方法。
（二）、自动化免疫法检测血清抗体。
        Saral Y[8]等人比较了用CMIA（Chemiluminescence Microparticle Enzyme Immunoassay，化学发光酶免疫检测），RPR及TPHA三种方法检测117位梅毒患者的结果，发现和TPHA相比，RPR与CMIA的灵敏度分别是58%vs 98%，特异性是0% vs 100%，说明自动化的酶联免疫系统可以减少诊断错误。reaction研究
        但是Ozbek OA[9]用CMIA法检测了2007年1月至2010年二月间12195份血清标本，如果CMIA阳性，就用RPR和TPHA重测，研究发现，如果RPR滴度大于≥ 1/32，CMIA的S/CO值大于21；当CMIA的S/CO值大于12时，其结果与TPHA和RPR的符合率是100%，但当S/CO值小于12，只有19.1%的CMIA阳性与TPHA相符，说明低值的CMIA并不能准确判断阳性结果。
        2010年-2013年，相继有学者报道利用[10-12]一种新的 化学发光免疫法chemiluminesc
ence immunoassay（CLIA）检测梅毒。CLIA法是一步夹心法，特异性梅毒抗原（TpN15，TpN17，TpN47）包被在板上，病人血清和异氨基苯二酰肼-抗原结合物一起混合孵育一小时，经过清洗和加发光底物后进行检测。作者报道，与TPPA相比，其特异性为99.9%，敏感度为100%，且对于原发梅毒，其诊断敏感度要高于TPPA，因而在不久的将来，手工TPPA法被自动化的CLIA法取代可能会成为趋势。
        也有学者【13-14】报道用其他自动化方法如GICA（Gold immunochromatography assay）等方法检测梅毒抗体，认为其灵敏度和特异性均达到FTA-ABS法，可以取代传统的FTA-ABS法。
（三）、自动化免疫浊度实验。
1、RPR的自动化检测。
        RPR试验，又称快速血浆反应素环状卡片实验，是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇颗粒混合并加入活性碳组成的复合物为抗原，能快速简便地测定梅毒患者血清中的非特异性抗体，结果容易判断。梅毒在人体内感染活动的程度基本与RPR定量试验成正比例，当梅毒经过，感染全部控制后，RPR转为阴性，当梅毒复发后，再感染则其定量实验的滴度相应增高。因此，RPR是观察效果、复发、或再感染的重要指标。在临床中也是做为初筛最普
遍使用的实验。对其实现自动化定量操作，一直是研究者关注的热点。
        Noh J[15]评估了Mediace，一种日本生产的可在生化仪上使用的RPR自动化试剂，检测了8个初次感染，7个二次感染，35个潜伏感染的病人，74个RPR、TPHA已确诊阳性的病人，108个献血者，并与FTA-ABS 法，传统的RPR实验，TPHA实验进行比较，发现Mediace有较高的假阳性率。
        2009年，Kim YS[16]比较了两种RPR自动化试剂：Mediace RPR（日本）及HBi Auto RPR（韩国），与手工法的结果比较，并用WB法做确诊，发现两种自动化试剂与手工法的符合率分别只有83.8%和83.2%，在RPR滴度为1：16时，Mediace RPR还有前带现象，R.U值与RPR滴度也不成线性。因此，认为现有的商业试剂不能很好地替代手工法，需进一步改进。
        2014年，日本学者【17】对68名梅毒患者，其中包括57名HIV病人进行了为期两年的观察，同时用手工法和机器法进行RPR检测，发现自动法可以替代手工法进行HIV阳性或HIV-阴性伴梅毒病人的检测，尤其是在阶段。
但总体而言，RPR自动化试剂仍需进一步改进。
2、自动化TPPA试验
        Choi SJ等人[18-19]近年来使用HiSens Auto RPR和 Auto TPPA，同样是胶乳浊度试验，并可以进行定量检测，所有样品均由临床自动生化仪自动检测，其中RPR以比值小于1.0为阴性，TPPA 以抗体浓度小于10U/mL为阴性，VDRL 和FTA-ABS为手工操作，研究发现，自动化RPR试验和VDRL相比，符合率为67.5%。而自动化TPPA与FTA-ABS的符合率高达96.4%，自动化RPR试验有高的特异性，但敏感度不如VDRL，而自动化的TPPA试验灵敏度和特异性都达到了98.0%。因而建议用自动化RPR和TPPA在临床上取代常规的梅毒检测试验。
        由于自动化检测的出现，学者们甚至提出了反向检测梅毒策略【20】，即以自动化检测梅毒抗体做为初筛，RPR试验做为疾病程度和效果的观察指标，虽然这种说法目前还有争议，但是自动化定量检测梅毒已成为一种发展趋势。
参考文献：
[1]Tucker JD，Yin YP，Wang B，et al. An expanding syphilis epidemic in China：epidemiology，behavioural risk and control strategies with a focus on low-tier female sex workers and men who have sex with men. Sex Transm infect 2011，87：ii16-ii18
[2]Muessiq KE，Cohen MS.Editorial commentary：China，HIV，and syphilis among men
who have sex with men：an urgent call to action.Clin Infect Dis，2013，57（2）：310-313
[3]张建军，曾艳，张秀兰等。苍白密螺旋体及RCH母婴垂直传播的研究。中华医院感染学杂志，2011，13：2667-2668
[4]李丹，崔巍，高伟。血清中梅毒抗体检测的研究进展。内蒙古医学杂志，2010，42（3）：321-324
[5]Burstain JM，Grimprel E，Lukehart SA，et al.Sensitive detection of Treponema palliidumby using the polymerase chain reaction.J Clin Microbiol，1991：29；62-69
[6]Gayet –Ageron A，Lautenschlager S，Ninet B，et al. Sensitivity，specity and likelihood ratios of PCR in the diagnosis of syphilis：a systematic review and meta-analysis. Sex Transm Infect，2013，89（3）：251-256
[7]Grange PA，Gressier L，Dion PL，et al.Evaluation of a PCR test for detection of trponema pallidum in swabs and blood. J Clin Microbiol，2012，50（3）：546-552
[8]Saral Y，Dilek AR，Dilek N，et al. Serologic diagnosis of syphilis：comparison of different diagnostic methods. Acta Dermatovenerol croat，2012；20（2）：84-8
作者简介：张建军，1971年12月出生，男，汉族，主任技师，研究方向：性传播疾病梅毒的母婴传播与梅毒脂质抗体的研制
基金项目名称：定量检测梅毒脂质抗体的试剂的研制
绍兴市一般科技项目---公益性技术应用研究计划
基金编号：2012B70061

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