原花青素调控抑癌基因p53/AMP 活化蛋白激酶通路抑制多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞自噬的实验研究
王漫丽
作者单位：洛阳市妇幼保健院产科一区，河南
洛阳471000
摘要：目的
观察原花青素对多囊卵巢综合征（PCOS ）大鼠颗粒细胞自噬的抑制作用，并探讨其对抑癌基因p53（p53）/AMP
活化蛋白激酶（AMPK ）通路的调控作用。方法
60只成年雌性SD 大鼠按照1~60自然数编号后以随机数字表法分为N 组、M
组、P 组、LD 组、MD 组和HD 组，每组各10只。除N 组外均建立PCOS 模型。P 组于建模成功后给予枸橼酸氯米芬溶液5.21mg/kg 灌服；LD 组、MD 组和HD 组分别给予25、50、100mg/kg 原花青素灌服，N 组和M 组均给予等量生理盐水灌服，连续24d 。对比前后血清性激素水平；苏木精-伊红（HE ）染
观察卵巢组织病理学变化；流式细胞术测定卵巢颗粒细胞自噬率；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT -PCR ）测定卵巢组织p53、AMPK mRNA 表达；蛋白质印迹法（Western blotting ）检测p53、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、AMPK 蛋白表达及AMPK 的磷酸化水平（p -AMPK ）。结果
后N 组血清性激素水平与
前比较差异无统计学意义（P >0.05），M 组血清睾酮、促黄体生成素（FSH ）水平均升高，雌二醇水平下降（P <0.05）；前M 组、P 组、LD 组、MD 组和HD 组血清睾酮、FSH 水平均高于N 组，雌二醇水平均低于N 组（P <0.05）；后P 组、LD 组、MD 组和HD 组颗粒细胞自噬率分别为（11.20±1.82）%、（13.45±2.10）%、（11.08±1.79）%和（9.86±1.05）%，每两组间血清睾酮、FSH 水平和颗粒细胞自噬率对比，N 组<HD 组<MD 组/P 组<LD 组<M 组，除MD 组与P 组差异无统计学意义（P >0.05），余每两组间差异有统计学意义（P <0.05）；后每两组间血清雌二醇水平对比，N 组>HD 组>MD 组/P 组>LD 组>M 组，除MD 组与P 组差异无统计学意义（P >0.05），余每两组差异有统计学意义（P <0.05）；N 组卵泡排列整齐，大小均匀，结构清晰，颗粒细胞规整，可达8~9层，大多均可见卵丘，余五组均有不同程度改变，HD 组与N 组接近；各组卵巢组织p53mRNA 、p53、LC3Ⅱ蛋白表达及p -AMPK 水平差异有统计学意义（P <0.001），每两组间对比，N 组>HD 组>MD 组/P 组>LD 组>M 组，除MD 组与P 组差异无统计学意义（P >0.05），余每两组间差异有统计学意义（P <0.05）；每两组间LC3Ⅱ蛋白表达及p -AMPK 对比，N 组<HD 组<MD 组/P 组<LD 组<M 组，除M
D 组与P 组差异无统计学意义（P >0.05），余每两组间差异有统计学意义（P <0.05）；各组卵巢组织AMPK mRNA 及蛋白表达差异无统计学意义（P >0.05）。结论
原花青素可改善PCOS 大鼠性激素水平，减轻病理改变，抑制颗粒细胞自噬，推测是通过调控
p53/AMPK 通路，上调p53基因及蛋白表达，抑制AMPK 的磷酸化，控制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化实现的。
关键词：多囊卵巢综合征；原花青素；颗粒细胞；自噬；抑癌基因；AMP 活化蛋白激酶；大鼠，Sprague -Dawley
Proanthocyanidin regulates p53/AMPK pathway to inhibit autophagy of granulosa cells
in rats with polycystic ovary syndrome
WANG Manli
Author Affiliation:First Ward of Obstetrics,Luoyang Maternal and Child Health Hospital,Luoyang,Henan 471000,
China
Abstract ：Objective
To observe the inhibitory effect of proanthocyanidins on autophagy of granulosa cells in rats with polycystic
ovary syndrome (PCOS),and to explore the regulatory effect of proanthocyanidins on p53(p53)/adenosine monophosphate -activated pro‐tein kinase (AMPK)pathway.Methods
Sixty adult female SD rats were assigned into N group,M group,P group,LD group,MD group
and HD group by the random digital table method,with 10rats in each group.PCOS models were established except N group.Group P
was given clomiphene citrate solution 5.21mg/kg after successful modeling.LD group,MD group and HD group were given 25,50,100mg/kg proanthocyanidins respectively,while N group and M group were given the same amount of saline for 24days.Serum sex hor‐mone levels were compared before and after treatment.Histopathological changes of ovarian tissue were observed by hematoxylin -eosin
(HE)staining.The autophagy rate of ovarian granulosa cells was measured by flow cytometry.Real -time fluorescence quantitative re‐verse transcription polymerase chain reaction (qRT -PCR)was used t
o detect the expressions of p53and AMPK mRNA in ovarian tis‐sues.The expressions of p53,microtubule -associated protein 1light chain 3(LC3Ⅱ),AMPK protein and phosphorylation of AMPK (p -AMPK)were detected by Western blotting.Results
After treatment,there was no significant difference in serum sex hormone level in
group N in comparison with pre -treatment (P >0.05),while serum testosterone (T)and follicle -stimulating hormone (FSH)levels in‐
◇药学研究
◇
引用本文：王漫丽.原花青素调控抑癌基因p53/AMP 活化蛋白激酶通路抑制多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞自噬的实验研究［J ］.安徽医药，2021，25（6）：1104-1108.DOI ：10.3969/j.issn.1009-6469.2021.06.010.
creased,and estradiol(E2)level decreased in group M,with statistically significant differences(P<0.05).B
efore treatment,serum T and FSH levels in groups M,P,LD,MD and HD were higher than those in N group,and E2levels were lower than that in N group,with sta‐tistically significant differences(P<0.05).After treatment,the granulocyte autophagy rates in groups P,LD,MD and HD were(11.20±1.82)%,(13.45±2.10)%,(11.08±1.79)%and(9.86±1.05)%respectively.When comparing the levels of serum T and FSH and the granu‐locyte autophagy rates between any of the two groups,the orders from low to high were groups N,HD,MD/P,LD and M.Except that there was no statistically significiant difference between group MD and group P(P>0.05),there were statistically significant differences between any of the other two groups(P<0.05).When comparing the levels of serum E2between any of the two groups after treatment, the orders from high to low were groups N,HD,MD/P,LD and M.Except that there was no statistically significant difference between group MD and group P(P>0.05),there were statistically significant differences between any of the other two groups(P<0.05).In group N,follicles lined up neatly,with uniform size,clear structure and regular granular cells,reaching8-9layers.Cumulus oopholus could be seen in most of the follicles.The remaining5groups had different degrees of changes.Group HD was close to group N.There were statistically significant differences in the expressions of p53mRNA,p53,LC3Ⅱprotein and p-AMPK in ovarian tissues among all the groups(P<0.001).When comparing the expressions of p53mRNA and p53between any of the two groups,the orders from high to low were groups N,HD,MD/P,LD and M.Exc
ept that there was no statistically significant difference between group MD and group P(P> 0.05),there were statistically significant differences between any of the other two groups(P<0.05).When comparing the expressions of LC3Ⅱprotein and p-AMPK,the orders from low to high were groups N,HD,MD/P,LD and M.Except that there was no significant dif‐ference between group MD and group P(P>0.05),there were statistically significant differences between any of the other two groups(P< 0.05).There were no statistically significant differences in the expressions of AMPK mRNA and protein among all the groups(P>0.05). Conclusions Proanthocyanidins can improve the level of sex hormones,alleviate pathological changes and inhibit autophagy of granu‐losa cells in PCOS rats.It is presumed that such influence can be achieved by regulating the p53/AMPK pathway,up-regulating the ex‐pressions of p53gene and protein,inhibiting the phosphorylation of AMPK,and controlling the transformation of LC3Ⅰto LC3Ⅱ. Key words：Polycystic ovary syndrome;Proanthocyanidins;Granulosa cells;Autophagy;Tumor suppressor genes;Adenos‐ine-activated protein kinase;Rats,Sprague-Dawley
多囊卵巢综合征（PCOS）是妇科临床常见的内分泌功能紊乱疾病，也是育龄期女性继发不孕症的常见病因。据统计，我国育龄期女性中PCOS的发病率约为5%~10%，且随着女性生活压力的剧增呈增长趋势，可并发不孕症［1］、糖尿病、高血压、甚至是子宫内膜癌等，危害甚重。目前临床上常用的
PCOS疗法有药物调节内分泌、改善胰岛素抵抗等，对有强烈生育愿望者给予来曲唑或克罗米芬等促排
卵，有一定作用，但临床效果有限［2-3］。既往报道显示，卵巢颗粒细胞自噬可维持卵巢生殖功能，正常情况下卵巢细胞增殖和自噬、凋亡处于平衡状态，而卵巢颗粒细胞自噬异常激活可能是PCOS发生的重要机制［4］。而抑癌基因p53（p53）/AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号转导通路可参与调控卵巢颗粒细胞自噬，可作为PCOS药物开发的新靶点［5］。原花青素是一种生物类黄酮混合物，具有特殊的分子结构，可从蓝莓叶、葡萄籽等中提取，属于一种强效抗氧化剂［6］。有研究发现，原花青素可调控恶性肿瘤细胞的自噬，还可减轻PCOS并动脉粥样硬化模型大鼠的病理改变［7-8］。但原花青素是否可通过调控p53/AMPK通路抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞自噬仍需深入研究，而探讨该课题可为此类病人新药的研究与开发提供方向，故于2018年4月至2019年6月开展如下动物实验。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物60只雌性SD大鼠，无特定病原体（SPF）级，7~9周龄，体质量范围为200~260g，购自郑州大学医学院实验动物中心［SCXK（豫）-
20180001］，卫生检疫合格，本研究符合一般动物实验伦理学原则。
1.1.2主要试剂及仪器原花青素（沈阳中科药业有限责任公司，国食健字G2*******，批次180415A，提纯
后纯度≥98%）；来曲唑（浙江海正药业股份有限公司，批号H20084597，批次1805116）；羧甲基纤维素（CMC）（南京道斯夫生物科技有限公司）；枸橼酸氯米芬（广州康和制药有限公司，批号H44021970，批次201804102）；睾酮检测试剂盒、促黄体生成素（FSH）检测试剂盒、雌二醇检测试剂盒（均购自南京建成生物研究所）；苏木精-伊红（HE）染试剂盒、单丹磺酰尸胺（MDC）染试剂盒、Trizol试剂盒、蛋白提取试剂盒（均购自法国生物梅里埃公司）；二氨基联苯胺（DAB）显液（购自深圳晶美生物科技有限公司）；兔抗鼠p53、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、AMPK、p-AMPK单克隆抗体、酶标记的山羊抗兔p53、LC3Ⅱ、AMPK、p-AMPK多克隆抗体（均购自美国Santa Cruz公司）。
RT-6000型酶标仪（购自美国Rayto公司）；DSZ-
70PHC型光学显微镜（购自日本Carton公司）；5084R型台式离心机（购自德国Eppendorf公司）；Cytomics™FC500型流式细胞仪（购自美国Beck‐man Coulter公司）；2720型聚合酶链扩增反应仪（购自美国ABI公司）；PowerPac Basic型电泳仪（购自美国Bio-Rad公司）；EPS300型蛋白质电泳仪（购自美国Thermo公司）；Trans-Blot SD型转膜仪（购自美国Bio-Rad公司）。
1.2方法
1.2.1分组、建模及干预60只成年雌性SD大鼠按照1~60自然数进行编号，以计算机生成随机数字表，按
照随机、均等原则分为N组、M组、P组、LD组、MD组和HD组，每组各10只。除N组外均建立PCOS模型。建模方法：来曲唑灌服，剂量为1mg/ kg，溶于1%CMC中，连续21d；N组同时灌服等容积、等浓度的基质羧甲基纤维素，共21d。参照文献方法验证模型［9］。然后P组给予枸橼酸氯米芬溶液5.21mg/kg灌服，LD组、MD组和HD组分别给予25、50、100mg/kg原花青素灌服，N组和M组均给予等量生理盐水灌服，均每天1次，连续24d。
1.2.2血清性激素水平检测包括睾酮、FSH、雌二醇。分别于前后抽取尾静脉血5mL，3500r/ min离心15min取血清，采用化学发光法（睾酮）、酶联免疫吸附测定（FSH、雌二醇）检测，需按照对应试剂盒说明书操作。
1.2.3卵巢组织病理观察取0.4%0.1 mL/kg腹腔注射，大鼠昏迷后取75%乙醇对腹部皮肤常规消毒，将腹腔打开并取出新鲜的卵巢组织。中性福尔马林浸泡固定，梯度浓度乙醇溶液脱水，包埋并切片，HE染试剂盒处理，封片并以光学显微镜放大观察。
1.2.4卵巢颗粒细胞自噬率检测将卵巢组织取出后以生理盐水冲洗，5min×3遍。将脂肪组织剔除，刺破卵泡，磷酸盐缓冲液冲洗，200目筛过滤。离心处理，参数：800r/min，5min。取沉渣，调整细胞浓度，至1×106个/毫升。MDC染，浓度0.05 mmol/L，37℃温育60min并以磷酸盐缓冲液清洗。以流式细胞仪术检测卵巢颗粒细胞自噬率。
reaction研究
1.2.5卵巢组织p53、AMPK mRNA表达检测取卵巢组织，匀浆研磨，以试剂盒提取总核糖核酸，反转录。配置反应体系，其中p53正向引物：5’-ACTGC‐TAGATTAGAGCTAGATCGA-3’，反向引物：5’-CT‐GCTAGATCGATATTAGCTATAGCGAT-3’；AMPK正向引物：5’-CTCGATAGGATCGATAGATCGAAC-3’，反向引物：5’-CTCGATATGATCTAGTATAGATCA‐GA-3’；β肌动蛋白（β-actin）：正向引物：5’-CT‐GCTCGATAGATCGATAGCTAGC-3’，反向引物：5’-CTGCTGATAGCTAGCTAGGGATTC-3’。以PCR仪反应，条件：95℃、10min，40个循环：95℃、10s→60℃、20s→72℃、20s，60℃、5min。取产物电泳，分析并计算目的基因的表达量，即2−ΔΔCt。
1.2.6卵巢组织p53、LC3Ⅱ、AMPK蛋白表达及p-AMPK检测采用蛋白质印迹法，取卵巢组织匀浆研磨，灭活并以磷酸盐缓冲液冲洗。提取总蛋白，定量后上样电泳，脱脂奶粉封闭，室温下孵育1h。滴加一抗，4℃下孵育过夜；磷酸盐缓冲液冲洗，滴加二抗，37℃下孵育2h，再次以磷酸盐缓冲液冲洗。以DAB显，以蒸馏水终止显反应，暗室曝光、显影和定影。拍照扫描，计算蛋白相对表达量，即目的蛋白与内参（β-actin）的比值。
1.3统计学方法以SPSS25.0软件为检验工具，以xˉ±s描述计量资料，多样本对比以单因素方差分析，每两样本对比以SNK-q检验，前后对比以配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1前后血清性激素水平对比N组、M组、P 组、LD组、MD组和HD组分别有1只、3只、2只、1只、1只和1只大鼠非正常原因死亡，均剔除。各组前后血清睾酮、雌二醇和FSH对比差异有统计学意义（P<0.001），后N组血清性激素水平与前差异无统计学意义（P>0.05），M组血清睾酮、FSH水平均升高，雌二醇水平下降（P<0.05）；前后M组、P组、LD组、MD组和HD组血清睾酮、FSH 水平均高于N组，雌二醇水平均低于N组（P<0.05）；后P组、LD组、MD组和HD组血清睾酮、FSH水平均低于M组，雌二醇水平均高于M组（P<0.05）；后LD组血清睾酮、FSH水平均高于P组，雌二醇水平低于P组（P<0.05）；MD组血清性激素水平与P组差异无统计学意义（P>0.05）；HD组血清睾酮、FSH水平均低于P组，雌二醇水平高于P组（P< 0.05）；LD组、MD组和HD组血清性激素水平均呈剂量依赖性，每两组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2卵巢组织病理学变化观察N组卵泡排列整齐，大小均匀，结构清晰，颗粒细胞规整，可达8~9层，大多均可见卵丘；M组卵泡排列严重紊乱，大小明显不一，结构极度混乱，颗粒细胞紊乱且排列稀疏，细胞层仅1~2层，仅有极少量黄体组织；P组卵泡排列稍显紊乱，大小不均，结构轻微混乱，颗粒细胞排列紊乱且轻微稀疏，颗粒细胞5~6层，有黄体组织；LD组卵泡排列紊乱，大小不均，结构混乱，颗粒细胞排列明显紊乱且排列稀疏，颗粒细胞仅3~4层，
有少量黄体组织；MD 组与P 组相近；HD 组卵泡排列稍显紊乱，基本均匀，少部分结构不清，颗粒细胞大多相对规整，可达7~8层，可见卵丘。2.3
卵巢颗粒细胞自噬率对比
N 组、M 组、P 组、
LD 组、MD 组、HD 组卵巢颗粒细胞自噬率分别为（7.12±0.56）%、（18.93±3.12）%、（11.20±1.82）%、（13.45±2.10）%、（11.08±1.79）%、（9.86±1.05）%（F =
41.368，P <0.001）。与N 组比较其余五组均升高，与M 组比较，P 组、LD 组、MD 组和HD 组均下降，与P 组
卵巢颗粒细胞自噬率比较，LD 组升高、LD 组下降，与LD 组比较，MD 组、HD 组卵巢颗粒细胞自噬率均下降，且HD 组低于MD 组（P <0.05）。2.4
卵巢组织p53、AMPK mRNA 表达对比
各组
卵巢组织p53mRNA 表达对比，差异有统计学意义（P <0.001）；各组卵巢组织AMPK mRNA 表达差异无统计学意义（P >0.05）。见表2。2.5
卵巢组织p53、LC3Ⅱ、AMPK 蛋白表达及p -AMPK 对比
各组卵巢组织p53、LC3Ⅱ蛋白表达
及p -AMPK 对比差异有统计学意义（P <0.001）；各组卵巢组织AMPK 蛋白表达差异无统计学意义（P >0.05）。见表3、图1。3
讨论
PCOS 常见的病因有下丘脑-垂体-卵巢轴功能
表1
各组大鼠前后血清性激素水平对比/x
ˉ±s 组别N 组M 组P 组
LD 组
MD 组HD 组F 值P 值
鼠数978999
睾酮/（μg/L ）
前0.069±0.0130.401±0.087①0.399±0.090①0.391±0.092①0.403±0.085①0.402±0.080①
12.9860.001
后0.071±0.0150.537±0.102①②
0.156±0.030①②③
0.207±0.041①②③④0.154±0.031①②③⑤
0.120±0.029①②③④⑤⑥
112.079<0.001
雌二醇/（ng/L ）
前92.867±15.14274.809±13.067①74.962±12.900①74.613±13.187①74.265±13.199①74.306±13.295①
15.483
<0.001后
92.463±15.801
65.405±12.018①②84.801±10.219①②③
80.696±11.204①②③④84.762±10.085①②③⑤
88.743±10.654①②③④⑤⑥
108.955<0.001
促黄体生成素/（IU/L ）前1.454±0.0252.612±0.036①2.597±0.041①2.608±0.039①2.610±0.041①2.599±0.042①
16.976
<0.001后1.462±0.0273.046±0.042①②
1.760±0.030①②③
1.976±0.035①②③④1.758±0.032①②③⑤
1.612±0.030①②③④⑤⑥
84.676<0.001
注：①与N 组对比，P <0.05。②与前对比，P <0.05。③与M 组对比，P <0.05。④与P 组对比，P <0.05。⑤与LD 组对比，P <0.05。⑥与MD 组对比，P <0.05。
表3
各组大鼠卵巢组织p53、LC3Ⅱ、AMPK 蛋白表达及p -AMPK 对比/x
ˉ±s 组别N 组M 组P 组LD 组
MD 组HD 组F 值P 值
鼠数978999
p53蛋白
1.32±0.25
0.16±0.03①
0.80±0.11①②
0.97±0.14①②③0.78±0.10①②④
0.30±0.04①②③④⑤
48.991<0.001
LC3Ⅱ蛋白
0.03±0.010.88±0.09①
0.47±0.07①②
0.52±0.07①②③0.45±0.06①②④
0.10±0.02①②③④⑤
82.149<0.001
AMPK 蛋白1.20±0.231.22±0.211.26±0.241.19±0.221.18±0.231.24±0.221.7520.128
p-AMPK
0.09±0.02
1.20±0.14①
0.46±0.07①②
0.78±0.12①②③0.45±0.07①②④
0.26±0.05①②③④⑤
43.597<0.001
注：p53为抑癌基因p53，LC3Ⅱ为微管相关蛋白1轻链3Ⅱ，AMPK 、p-AMPK 分别为AMP 活化蛋白激酶及其磷酸化。①与N 组对比，P <0.05。②与M 组对比，P <0.05。③与P 组对比，P <0.05。④与LD 组对比，P <0.05。⑤与MD 组对比，P <0.05。
表2
各组大鼠卵巢组织p53、AMPK mRNA 表达对比/x
ˉ±s 组别N 组M 组P 组LD 组
MD 组HD 组F 值P 值
鼠数978999
p53mRNA
1.26±0.180.48±0.08①
0.80±0.13①②
0.62±0.10①②③0.78±0.13①②④
1.09±0.15①②③④⑤
165.863<0.001AMPK mRNA 0.89±0.120.92±0.150.90±0.130.87±0.140.88±0.150.90±0.141.9870.103
注：p53为抑癌基因p53，AMPK 为AMP 活化蛋白激酶。①与N 组对比，P <0.05。②与M 组对比，P <0.05。③与P 组对
比，P <0.05。④与LD 组对比，P <0.05。⑤与MD 组对比，P <0.05
。
56
241
3N 组M 组
LD 组HD 组
P 组
MD 组注：1―β肌动蛋白（β-actin ）；2—AMPK （AMP 活化蛋白激酶）；3—p -AMPK 为磷酸化AMP 活化蛋白激酶；4—LC3Ⅱ（微管相关蛋白1轻链3Ⅱ）；5—LC3Ⅰ为微管相关蛋白1轻链3Ⅰ；6—抑癌基因p53。图1
蛋白质印迹法检测各组大鼠卵巢组织p53、LC3Ⅱ、AMPK
蛋白表达及p -AMPK
异常、代谢紊乱、肾上腺功能失常及遗传等，可引起被膜纤维化增厚，导致卵巢囊性增大、影响正常排卵［10］。目前人们对该病的具体机制认识尚浅，且临床方案多缺乏特异性，而新药研究也缺乏靶点，因此采用新的药物通过已知的途径发挥作用是目前重要课题。卵巢颗粒细胞自噬与卵细胞的发育、排出等生理过程均有密切关联，细胞自噬与细胞生物学改变有密切关系［11］。而抑制卵巢颗粒细胞自噬是当前针对PCOS新药研究的热点。
本研究中，P组、LD组、MD组和HD组后血清性激素水平均显著改善，M组后血清性激素水平均显著恶化，N组均无明显变化，且后HD 组血清性激素水平改善最理想，可知原花青素和枸橼酸氯米芬均有助于改善PCOS大鼠血清性激素水平。睾酮主要由卵巢、腺外组织、肾上腺皮质转化，在PCOS发病过程中，睾酮显著升高，主要原因是卵泡雄激素浓度过高，可促进黄体细胞内雄激素转化为双氢睾酮，抑制卵巢的正常发育［12］；雌二醇主要来源是卵巢，在PCOS发生过程中可导致雌激素不足，抑制黄体细胞内雄激素向雌激素的转化，因而其水平较低［13］；FSH主要由垂体前叶促性腺激素细胞分泌，可刺激颗粒细胞增生和卵泡生长发育，在
PCOS中FSH的水平显著升高，且对PCOS病情有评估作用［14］。因此在PCOS中应积极调控血清性激素水平。原花青素是目前公认的高效自由基清除剂和天然抗氧化剂，常用于抗氧化应激损伤，
在PCOS中的作用报道尚少。结合上述分析和本研究结果，推测原花青素可调控PCOS大鼠血清性激素水平，且高浓度的原花青素对其调控作用明显优于枸橼酸氯米芬，显示出良好的挖掘价值。在本研究HE病理学变化观察中显示，M组卵巢组织有严重的病理改变，P组、LD组、MD组和HD组均有所减轻，且HD组与N组最为接近，提示原花青素可减轻PCOS大鼠卵巢组织的病理学改变，且呈剂量依赖性。因此原花青素不仅可调控PCOS大鼠血清性激素水平，还可减轻卵巢组织病理改变。
此外，本研究关于卵巢颗粒细胞自噬率的对比结果中显示，N组<HD组<MD组/P组<LD组<M组，表明原花青素可抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞自噬，且其作用呈剂量依赖性。在基因及蛋白表达检测结果中显示，原花青素可上调p53基因及蛋白表达，抑制AMPK的磷酸化，控制LC3I向LC3Ⅱ转化，推测该药物很可能是通过上述途径实现抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞自噬的。成熟卵泡的颗粒细胞是卵泡最重要的单元，颗粒细胞增殖、分化在卵泡发育过程中均有参与，且可促进卵母细胞的发育与成熟。颗粒细胞是否凋亡可直接影响卵母细胞的发育潜能，而自噬与凋亡关系密切，有研究表明自噬是凋亡的引导机制，而LC3I向LC3Ⅱ转化是卵巢颗粒细胞发生自噬的重要表现［15-16］。p53/
AMPK信号通路在自噬过程中也有调控作用，其中p53基因与蛋白可负性调节细胞自噬，还可通过转录依赖性途径增加AMPK蛋白的磷酸化水平进而促进细胞自噬［17-18］。研究显示［19］，卵巢颗粒细胞自噬过程中，p53/AMPK通路不仅可参与直接调控，还可调控LC3I向LC3Ⅱ的转化间接影响细胞自噬。根据本研究结果和上述分析，推测原花青素可通过调控p53/AMPK通路，上调p53.基因及蛋白表达，
抑制AMPK的磷酸化，控制LC3I向LC3Ⅱ转化进而抑制卵巢颗粒颗粒细胞自噬的。
综上所述，在PCOS大鼠中给予原花青素灌服可改善血清性激素水平，减轻卵巢病理改变，抑制卵巢颗粒细胞自噬，且呈剂量依赖性，中剂量原花青素的效果与枸橼酸氯米芬均相近，而高剂量原花青素的效果均最佳，推测很可能与调控p53/AMPK 通路，上调p53基因及蛋白表达，抑制AMPK的磷酸化，控制LC3I向LC3Ⅱ转化有关。但其具体作用机制及在临床中应用的可行性仍需要进一步探讨，可作为进一步的研究方向。
参考文献
［1］宋颖，李蓉.多囊卵巢综合征中国诊疗指南解读［J］.实用妇产科杂志，2018，34（10）：737-741.
［2］MAHAJAN N，KAUR J.Establishing an Anti-Müllerian Hormone Cutoff for Diagnosis of Polycystic Ovarian Syndrome in Women of
Reproductive Age-Bearing Indian Ethnicity Using the Automated
Anti-Müllerian Hormone Assay［J］.J Hum Reprod Sci，2019，12
（2）：104-113.
［3］MARCHESAN LB，SPRITZER PM.ACC/AHA2017definition of high blood pressure：implications for women with polycystic ovary
syndrome［J］.Fertil Steril，2019，111（3）：579-587.
［4］LI X，QI J，ZHU Q，et al.The role of androgen in autophagy of granulosa cells from PCOS［J］.Gynecol Endocrinol，2019，35
（8）：669-672.
［5］HARAGUCHI H，HIROTA Y，SAITO-FUJITA T，et al.Mdm2-p53-SF1pathway in ovarian granulosa cells directs ovulation and
fertilization by conditioning oocyte quality［J］.FASEB J，2019，33
（2）：2610-2620.
［6］KUROWSKA P，MLYCZYŃSKA E，BARBE A，et al.Vaspin in the pig ovarian follicles：expression and regulation by different
hormones［J］.Reproduction，2019，158（2）：135-146.
［7］YANG N，GAO J，CHENG X，et al.Grape seed proanthocyani‐dins inhibit the proliferation，migration and invasion of tongue
squamous cell carcinoma cells through suppressing the proteinki‐
nase B/nuclear factor-κB signaling pathway［J］.Int J Mol Med，2017，40（6）：1881-1888.

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