第44卷第5期
2401年5月分析测试学报FENX 【CESHS XUEBAO (Jouoal cf Instomeatal Analysis)Vol. 02 Nc. 5643〜655
doi : H 3969/j ・ issm 1704 -4457. 2021・ 05・ 004
点击化学在食品安全检测中的应用研究进展谢桂芳，苏本超，谢晓霞，孙志昶，陈 奇，曹宏梅，刘 星*
*收稿日期：2224 -11 -19；修回日期：2241 -24-14
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31762493）
*通讯作者：刘 星，博士，副教授，研究方向：食品安全,E - mail : xliu@ hainanu. 1pu. 1a
（海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口 570228）
摘 要：点击化学因具有反应模块化、无有毒有害副产物、反应效率高等岀的反应性能备受关注，是继组 合化学之后又一新型合成技术，在材料表面功能化、大分子聚合物的合成、生物标记等领域得到了广泛应 用。点击反应试剂的活性基团易于修饰在其他化学基团上，表明点击反应有望作为中间反应介导特定反应
的信 号转换或放大。近几年岀现了大量基于点击化学构建的一系列分析检测方法，此类分析方法具有检测限低、线 性范围广、可对目标分析物进行准确定量的优势，有着良好的应用前景。经典的点击反应——“叠氮-烘环 加成（CuAAC ）”是点击反应中应用最为广泛的反应，具有传感反应所需的几个独特优势：（1）以Cu +作为催 化剂可极大提高反应效率以及反应灵敏度；（2）烘桂和叠氮基间的正交反应决定了良好的反应特异性；（3） 反应对环境条件（温度、水、pH 值等）不敏感，能够在室温和水溶剂条件下进行。这些良好的反应性能使得 利用CuAAC 反应构建灵敏度高、特异性好且稳定性强的传感检测方法成为可能。食品安全检测是控制食品 中危害物、保障公众健康的重要手段。当前食品安全监测常用的技术手段几乎都依赖于一些笨重的仪器设备 而无法具有较高检测效率，点击化学的优越性能为食品安全检测提供了新的思路。该文综述了点击化学的概 念、主要反应类型、反应原理以及特点，对基于点击化学的一系列快速检测方法如比法、荧光法、电化学 法等进行列表比较，并着重介绍了 CuAAC 反应在检测食品成分及添加剂、农残兽残、真菌毒素、重金属以 及食源性致病菌方面的应用实例，最后指岀了现阶段CuAAC 反应在应用中存在的不足，并对其在食品安全 检测等研究领域的应用前景进行了展望。
关键词：点击化学；食品安全；分析检测；应用
中图分类号：0657.1 文献标识码：A 文章编号：K04 -4957（2021）05 -0648 -08
Reseeoh Proyress on Applicetiou of Cbch Chemistry O Fooh Safety Detection
XU Gui-fang , SU Bea-chao , XU Xiao-xia - SUN Zhi-chang , CHEN Qi ,
CAO Hong-mei ： LIT XOg *
（Co/eye of FooU Science and Engi/eedno , Hainau Univeo/y , Haibou 570228 , Chino ）
AbstfdCt : Cbch chemistra has attracted much d/wtion due to its wcWUpl reaction peOoo/ices such as reaction mohuladty , no toxic and hdof/ by ・poUucts : rd high reaction W /O wcu . Sl is /other new type of syothwis technomgo /ter combinatodal chemisto ； which has bwa wibelp used in the fuychoua/zatiou of matedal sud/ce , syothwis of h/h polymers : bio-lane/nv and other mms.Sn additiox , the active yonys of clich reaction reayepls are wsily mohi/ed on other chemical yonys :Oidica/ng that the clich reaction ceulb be used as a promising intermediate reaction for mediating sip- nal conversion or amplification in cedaix reactions. Sn receal years : a laoe number of clich chemis- tol/W odywls have emeraed （ and have bwa applied to develop a sedes of analysis and detection me/ohs. Due to the aPvantayes of low detection limit , wide liyeas range and pphole quantification of /oW analytes : this type of analysis me/ohs have a yooh app/cation pospeeb The classic pppwi catalyzed dmywe/szibe cyPo/lcl//u （ CuAAC ） is the most wibWy used clich reaction which has sev eral unique aPva
ntayes required f os seasing reactions : fiotly ； the use of Ci/ as a catalyst coulb yoa/o improve the reaction eWicOacy and sws/mOy ； swendm ； the orthogondl reaction betweea at- eyne and azide determines the yooh specificity of the reaction , and thiOly ； the reaction is not swsi- tive to eavironmeata- condi/ons including temperature , wates , pH , etc. , and ceulb be pedooied at oom temperature os wates solveal condi/ons. These yooh reaction popedies made it possible to
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use CuAAC reaction to ceustmct sensing methods with high sensitivitp,yood specificitp and strong smUility.Food safetp detection is an impoCant means to control hazarUs in food and protect puUllc health.Al present,the commonly useC methods Oo food samta monitoPng almost alt rely on the chmy bersomc/stmmects and epuipmects,and thus resulting in the reductiou of detection e/iciedce.In this context,the supePor4x001111of clich chemistry provides new ideas for food samta detection.
The concept,main reaction types ,mactiou pPnciplcs and charyctePsticz of clich chemistry are r/y
viewed in this a/icte,and a seces of rapid detection methods based on clich chemistry such as colopy met/,/uorescecce method,emctrochemicyt method,etc.are also compared.Moreover,the apy plication e
xxmplcs of CuAAC reaction in the detection of food ingrepiects and additives,p/ticidc and vetePna/dma residues,mycotoxins ,heava metals and foodOomc p/hey/ps are hmhiighted.FU ndUy ,the s hoCcomings of clich chemistry reactions at the chrrect stayc are pointed out,and the U p ture application prospects of clich chemistry in food safety detection and other research/elds are pmw ected.
Key words:clich chemist/,food safety,analysis and detection；application
1点击化学简介
点击化学(Clich chemist/)由化学家SSamless于2041年首次提出5，又叫"链接化学"、"速配接合组合化学”，是一种新型合成方法，其核心是通过一系列可靠高效又具有选择性及模块化的化学反应生成含杂原子的化合物，从而实现碳杂原子的连接(C-X-C)，突破传统化学合成方法的制约。
点击化学通常具有以下特征：反应模块化，可与其他反应组合；无有毒有害等副产物；反应效率高，接近定量；反应条件温和，对水和氧气不敏感；立体选择性好；实验原料易得等。鉴于以上优势，点击化学已成为目前的热门研究领域之一，并在材料科学和合成领域得到了大量的应用［2-5］。
原位点击化学(In situ clich chemist/)［4］是目前点击化学在合成和其他应用中的常见方法。在合成过程
中，参与点击反应的物质均在溶液中生成，无需进行分离提纯，只需向反应液中加入另一种能与之发生点击反应的试剂即可，简化了实验步骤，也在一定程度上提高了反应速率。将原位点击化学应用于合成类天然产物的研究中，以酶为反应模板，选择性地连接各模块组分，可发现各种酶的高亲和力抑制剂5。Bhar/waj等50以环氧合酶2为反应容器，将叠氮基标记的毗U坐(5、14、26和31)和芳基乙快进行成对孵育，鉴定出4和21号为环氧合酶2的特异性抑制剂。与临床使用的抗炎药相比，化合物18和21表现出优异的体内抗炎活性。Himse等54利用生理条件下的惰性反应物进行不可逆的靶标导向合成，生成了高亲和的抑制剂。通过含叠氮化物N®-甲基氨基甲酰基氯-精氨酸与乙快库之间的特异性偶极环加成反应，筛选出高亲和力的几丁质酶抑制剂，为进一步开发抑菌物提供了理论基础。此外，原位点击化学也被应用于体内肿瘤靶向52］、抗HIV病毒因子的筛选55］，抗体合成53等生物医学领域。
随着各学科间的交叉融合，检测技术与点击化学联用后，展现出强大的分析检测性能［45。由于点击化学反应速率快、立体选择性好、对溶剂不敏感等特点，基于点击化学构建的分析方法具有检测限低、线性范围广、可对目标分析物进行准确定量的优势，在快速检测方面有着良好的应用前景。
2常见的点击化学反应分类
点击化学反应主要有4种：环加成反应、亲和开环反应、非醇醛的规基反应和碳碳多键的加成反应。
2.1环加成
环加成反应即充分利用模块化反应融合过程，将两种不饱和的反应物连接起来，形成各种五元杂环和六元杂环的反应，如Diets Alder反应及1,3-偶极环加成反应。研究最多的是1,3-偶极环加成反应，其中以快桂和叠氮基的反应最为突出，由Arthum6在1783年首次扌赭，后由Huispec等54正式确立为一类重要的新型反应。在一价铜的催化下，快基和叠氮基的不饱和键发生成环反应(CuAAC反
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应），形成1,2 ,3-三U坐，该反应可发生，氧气、pH值、温度等条件不敏感，为复杂有
机物的合成和生物大分子的改性提供了强有力的技术。随着各种交叉学科的，当前点击反应试的各CuAAC检测方已大量报主要检测、检测、学检测
(1)。
表1基于CuAAC反应的快速检测方法
Tadle1Rapid betectiox methoXs based ox the CuAAC reachox
MethoX Limil cf detection Reaaeats and materials cf Pich reaction
Colodme/io assay2242cfu/mL(Escheachio coli-Cuyric reductase NDH-f,azibc-AuNPs:aieyne环uNPs
T5immunoseasoO51 2.220no/mL(chlooydms)Azide环Sw22,amyuo-MNP32
Colodme/io K一4〜K-//Azibo-teoinal amyne-fuuchcxa/zep AuNPs:CuO, immunoseasoO25](50anopyospya/pesUciUez)ace/lcho/ue esteose-acety/hOcho/ue system
Fluoresceaj seasor222.13wr/C(/umioxaziu/0-Pzibc-P-pyproxycoumadu,CUSO4,soXium ascorUate
EIS wawr24] 4.0pmol/P(ascorbic acid)Proparoyl muchcxa/zea mwoceae.azide terminal moXi/ed Au c-
lec/oXo.CUSO4
Colodme/io assay22 1.5mmol/P(reducing sugart Azibc-AuNPs:amyuo三u NPs:CuCf
PodaPlc sipnal-on70po/mL(ochratoxin A)AziUo-PNA-aptamer-Piotiu,amynyl-DNA-inveOase.
[26]
sensor CUSO4,ascorUato
Colodme/io seasor27] 1.0wmoUC(Cu5+/Azibo-tagoeb AuNPs:1,4-Pie/ypymeazeae,soXium ascorUate,
coppos sulUto
Electrochemical sen-81.94,327.71,55.87and347.06umol/P Low symmet/amyue terminated coXait pp/alocyaninc .aziboanO
[22]
sors(H o2+,Cu2+,Pb2+and Cb2+/Uno hyUrochlodbc terminated coXait ph/aUcyaniue
Fluoresceaj sepsoO25]8wmol/P(Ao+)BIAOL-Pasey cyclopPanc1iucoruoranng t/c t/azole moietiez ColodmeWic seasor22]4umol/P(Cu5+/Amyue-DNA,azibe-DNA
Fluoresceaj seasor21] 5.08pnol/P(H o2+/UiO-66-N3,phepylace/leae
Fluoresceat seasoO2]1pmol/P(Cu5+/Graphene oxide fuuchcxanzeb wi/alkyne,caOoxyOoXaniOellO-N Fluoresceaj seasor23] 2.08umX/P(C/2+)4-DziUoneazoio ocib-tagaed Au@SiO5,propio h o aciU-tagoed cas-
bon dots
CuAAC检测法通常具有反应基团易修饰、灵敏度好、结果可视化等优势，然而CuAAC反应需要引入一些具性的，生物医药以及食品领域的应。
2.2环
亲和开环主要是开环并释放张力能的过程，如环氧衍生物、烷、环状、环状、离。在这些合物中，环氧衍生物离子是最常用的底物，可/水混合或条开环形成各种高选择性化合物。此类反应还
a,0-不饱合物的成反应，主要然产物物的合成⑶-2］。
2.3基化
的反应又称“保护基反应”，是的合物缩合反应。此类反应i：醛或酮与1,3-二醇反应生成1,3-环氧；醛与脐或骸反应生成；a和0P、酮生成合物⑷-"打这些反应够的，且不产生产物。
2.4多键
碳碳多成反应将或成在碳碳端，生成具高分子量的化合物，包含环氧化反应、二反应、烷化反应、成以-烯反应反应。
因不需要、反应、具有点击反应的特性，-双键反应近年来已成为点击反应的研究热点。根据合物的不同，-双键反应分为反应机理：（1）在光或热的条，与烷桂单烯之间的自成；（2）有机碱（、磷化物等）作为催化与马来、（甲基）丙烯共U烯桂的-成。Cmophas等切-
点击化学具有优异抗菌性能的PEG基水凝胶，经测试，该黄葡萄球菌、葡萄球菌和大肠杆菌物具有＞99%的完全杀死率，-烯点击化学在抑菌方面的应用功能性。
第3期谢桂芳等：点击化学在食品安全检测中的应用研究进展651
3点击化学在检测分析中的应用
3.1食品成分及食品添加剂的检测
近年来，抗坏血酸常用作护剂被添加到食品中，而摄入过量的抗坏血酸会导致人体出现一系列不良反应。Qu等利用CuAAC点击化学反应构建了一种超灵敏检测抗坏血酸(AA)的电化学传感器，将快丙基功能化的二茂铁通过与修饰在金电极上的叠氮化末端发生点击反应修饰到电极上，并采用电化学交流阻抗法检测金电极在点击反应前后的电子转移电阻，以此确定不同浓度抗坏血酸的表面覆盖分数(0)。结就明，0值与抗坏血酸浓度对数值在5.2xl7-10~1.2xl7-7mol/P范围内呈线性关系。该传感器检测限低至43xlOtmO/L，选择性和稳定性良好，并已成功应用于抗坏血酸的实际检测。
李燕萍等54利用疏基丙酸修饰纳米金，并借助酰胺反应分别构建了快基和叠氮基修饰的两种不同的AuNPs，通过还原糖将CS+还原为Cu+触发两种AuNPs的CuAAC反应，实现了对还原糖的定量检测。该方法的检出限为4.2415pnoOP，可直接用于蜂蜜产品的还原糖检测。
3.2农残兽残检测
当前检测农兽药残留的金标准方法主要是高效液相谱-质谱法、气相谱和质谱法，但是这些方法前处理复杂，需借助各种大型仪器，不适用于快速检测。Dog等回］基于点击化学原理，开发了一种快速高灵敏检测毒死蝉的免疫分析方法。研究者分别制备了聚谷氨酸(PGA)、叠氮基修饰的聚苯乙烯(PGA-Ozid e-OS1000)纳米粒子和快基修饰的磁纳米颗粒(AlVykc-MNP s),PGA和Cu2+之间可通过配位化学结合形成刷状纳米结构，调节体系中Cm+的浓度可触发CuAAC。毒死蝉会阻止PGA-PS1400-抗原与MNPs-Ab之间形成MNPs-Ab-抗原-PS1004-PGA复合物，因此较少的Cu2+被PGA键合，溶液中更多游离CC+被抗坏血酸还原为Cu+从而发生CuAAC反应，导致PS1004-MNP30共U物的形成。MNPs聚集状态以及浓度变化均会使磁传感器的横向驰豫(T2)发生变化，可通过测定体系的T0值来检测毒死蝉。这种点击化学和配位化学介导的免疫传感器可实现对毒死蝉残留物的超灵敏检测，检测限(4-422ny/mL)较酶联免疫吸附法(1.23ng/mL)提高了55倍，所用时间也比金标准法短(图1A)。
纳米金颗粒易与硫醇形成稳定的Au—S键，Fu等52利用叠氮化物和快基化合物修饰的AuNPs之间的点击
化学反应，开发了一种快速、高灵敏、肉眼可视化检测有机磷农药的方法(图lB)o多孔有机骨架孔隙率高、比表面积大，在溶剂中有很好的稳定性，Wu等54通过光催化的疏-烯点击化学制备了高度交联的共价有机骨架(CFOs)，将其固定在化学惰性不锈钢纤维(SSF)上用作固相微萃取(SPME)的涂层，并与气相谱法联用对黄瓜中的农药残留量进行了检测。
杀矚剂氟咪U坐嗪的快基能够与3-叠氮氯-氯基香豆素反应，在Cu-催化下发生叠氮快环加成生成强荧光的1,2,3-三U坐,Lu等50据此开发了一种能够灵敏特异性检测氟咪U坐嗪的荧光传感方法，线性范围为2.25-6.2p c/P，检测限为2.18p/L(图1C)。
抗生素残留是继农药残留后又一严重的兽药残留问题，目前对食品中抗生素的检测仍以大型精密仪器分析法为主，其样品前处理复杂耗时，而点击化学与其他技术联用可大大缩短检测时长。Belal 等⑷］基于DNA适配体片段的互补作用以及Cu+催化的点击反应，开发出能够高灵敏、快速(2h内)检测卡那霉素的荧光分析法。主要机理为：一条DNA单链采用生物素修饰，另一条DNA单链采用CuS 纳米颗粒修饰，仅在卡那霉素存在的情况下这两条DNA单链互补形成双链，产生的卡那霉素-双链DNA-CuO经磁分离后，CuS被抗坏血酸还原为Cu+而触发3-叠氮基三-氯基香豆素与快丙醇之间的CuAAC反应，生成具有荧光的1,4-二取代三,2 ,3-三U坐。该反应体系荧光强度与卡那霉素浓度(2.24~22nmol/L)具有良好的线性关系，方法检测限低至22pmol/L。
XUnyu等加通过不同尺寸的反式环辛烯(TCO)功能化的聚苯乙烯珠(TCO-OS)和1, 2 , 6 ,5-四嗪(Ta)功能化的30nm磁珠(TZ-MNP30)之间的“TCO-Ta点击反应”制备了具有核-卫星结构的磁探针，结合抗体-抗原相互作用和磁分离，利用这些多功能磁探针产生的磁弛豫转换(Maynetlc relaxation switching,MRS)信号可实现对多种抗生素的高灵敏检测。用该方法分别进行土霉素、磺酰胺和氯霉素的含量检测，所得结果准确可靠，并有望进一步应用于生物医学和食品安全检测。
652分析测试学报第44卷
A
With target C B
Red (dispersed)ATCI A$c«rbatc
Cu
30(20(10(
cfcOOH Cu2________|
/ Reductant
k ifAzideJ^VlkyneJ … …
Blue (aggregated)Highh fluorescence Y Ueaklj fluorescence 0 Ascorbic 令妄 acid ....八 @
Polyglutamic acid ；总爭篦一UR 叽
acid " • N nW MNP lon -antibody ' AT 2=T 2(blank)-T 2(sample)P n NP 30-alkyne j ii . i S ■ ii ▲ BSA-chlorpyrifos i - Jx ▲ Chlorpyrifos ；Incubation •••
96-well plate 。 o
HSC lo H 2oCOT(C2H 40>2C2H4NHCC 2H4C s C H 0 0HSC 10H 30^NH(C J H 4O)2C 2H4NH&：2H^I=N=N
No target
图1基于点击化学引起T0信号值变化检测毒死脾(A ) 54，点击化学结合纳米金颗粒可视化检测有机磷农药(B ) 52],
利用点击化学生成强荧光的1 , 2 , 3-三哩(C )：23]
Fig. 1 Detection ol chlorayrifos based on changes in T 2 signot value coused by clich chemistry (A) 54 , combination ol clich chemistry and yoOS nanopacicles tv visualty detect omadophosphoms pesticides ( B ) 52 ] , pmpamUoc ol 1 , 2 , 3-t/azote with
digUty /poresceuce using clich chemist/( C) 53 ]
1. 3四zide-4四ykmxycomnaPd(3-叠氮化物四-叠基香豆素)；
2. /umioxazid (氟米嗪)；
3. 3四zide-4四ykmxycomnaPn + Cu 2 + + SA (3-叠氮化物四-叠基香豆素+二价铜离子+链霉亲和素)；
4. /umioxazin + Cu 2+ + SA (氟米嗪+二价铜离子+链霉亲和素)；
reaction研究5. 3四zide 四 -4ykroxycocmarin + Cu 2 ++ SA + /umioxazin ( 3 -叠氮化物四-叠基香豆素+二价铜离子+链霉亲和素+氟米嗪)
3.3真菌毒素检测
真菌毒素如黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA )、玉米赤霉烯酮(ZEN)等极易污染粮食、 谷物、
咖啡、啤酒 叶等，对动物 具有致畸、致癌、致突变和免疫抑 性作用56r 4]。当前，对AFB4 OTA 、ZEN 等的检测以传统的仪器分析法为主，如高效液相谱法50、薄层谱54等。 这类方法灵敏度高且准确性好，但 样品前处理复杂、需要专业操作人员和设 不足，限制
的推 。因此，开发低成本快速检测抗生素的方法作为大型精密 分析法的 补
尤为重要。
QU 等曲分别制备了叠氮基氯TA 适配体修饰的磁珠(N 氯TA 适配体-MBs , DNA1)和蔗糖转化酶 功 的 -DNA 偶联物(
DNA-蔗 酶，DNA2)，以 (Pe/ocat Uucosc meter ,PGM)作为信号 立 量OTA(72 py/mL )的检测方法。DNA1与DNA2间发生CuAAC 反应形成双链的dsDNA , OTA 时，OTA 与 结合， dsDNA 双链解开，经磁珠分离后上清液
的DNA2量增多，PGM 信号变强，从而实 0TA 的高灵敏检测。Xu 等[2]通过光引发多面体低聚倍半硅氧烷(卩。/^—/!/ o/gomeric silsespuioxxue , POSS)单体聚合 形成含活性烯基的刚性 ， 74兀下引 的玉米烯酮适体(SHZEN )和烯基间的“毓-烯点击化学”， 极性 致密 的亲 整体柱， 与HPLC 联 大 的ZEN 检测，实验结果准确可靠。Chep 等[53] 自 聚合和“硫醇-烯”点击反应， “一锅法”直
的 OTA. 的含POSS 杂合亲和性整体柱, 啤酒样品中OTA 的检测，该
特异性 够检测痕量OTA 。
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