重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体
外源性DNA残留量测定法(qPCR法)
1原理
实时定量PCR（qPCR）扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度变慢，反应进入平台期。
反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环数，即CT。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的CT；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的CT。两者之间关系的建立是qPCR用于定量的依据。
2主要仪器
表2 仪器信息表
名 称 | 厂 家 | 型 号 |
实时定量PCR仪 | Bio-Rad | CFX Connect |
3主要试剂
表3 试剂信息表
名 称 | 厂 家 | 规 格 |
残留DNA样品制备试剂盒 | ABI | 1）Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle; 2）Binding Solution,1 empty bottle; 3）Wash Buffer Concentrate, 2 bottles, 26 ml/bottle; 4）Elution Buffer; 1 bottle, 25ml; 5）Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml; 6）Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube; 7）Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml; 8）Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml; Glycogen, 2 tubes,5mg/ml,1.0ml/tube. |
残留DNA定量检测试剂盒（CHO） | ABI | 1)DNA Control,1 bottle,40μl; 2)DNA Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml; 3)2×Environmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube; 4)10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300μl; 5) Negative Control, 1 tube,1.0ml. |
4溶液配制
4.1 蛋白酶K混合液（新配）
附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）
1 reaction （100μl/sample） | 10 reaction （100μl/sample） | |
Proteinase K | 10μl | 100μl |
Proteinase K Buffer | 60μl | 600μl |
4.2 裂解混合液（新配）
试 剂 | 体 积（μl） |
Glycogen（5mg/ml） | 180 |
tRNA（10mg/ml） | reaction buffer4 |
Lysis Buffer | 7600 |
合 计 | 7784 |
4.3 DNA标准品稀释
Tube label | Dilution | pg/μl | pg/ reaction |
DNA Control | 30000 | 300000 | |
SD1 | 10μl DNA Control+990μl DDB | 300 | 3000 |
SD2 | 50μl SD1+450μl DDB | 30 | 300 |
SD3 | 50μl SD2+450μl DDB | 3 | 30 |
SD4 | 50μl SD3+450μl DDB | 0.3 | 3 |
SD5 | 50μl SD4+450μl DDB | 0.03 | 0.3 |
SD6 | 50μl SD5+450μl DDB | 0.003 | 0.03 |
NTC | DDB | 0 | 0 |
注：DNA标准品溶液4℃放置保存1天，-20℃放置保存1周。
5测定方法
5.1样品处理
5.1.1除蛋白
1）在2ml离心管中加入100μl样品；
2）每100μl的样品中加入70μl的蛋白酶K混合液，混合均匀，56℃水浴30min；
3）每100μl的样品中加入360μl的裂解液，室温裂解2小时以上。
5.1.2 DNA的纯化
1）磁珠使用前于37℃温浴10min，高速涡旋，彻底悬浮磁珠；
2）每100μl的样品加入30μl的磁珠悬浮液；
3）每100μl的样品加入300μl的Binding Solution，涡旋混合5min；
4）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置5min直至溶液清澈，弃上清；
5）从磁力架上取下离心管，加入300μl的Wash Buffer，涡旋混合5 sec；
6）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，弃上清；
7）重复步骤6）1次，打开离心管的盖子，室温下风干；
8）加入50μl的Elution Buffer，高速涡旋10 sec，70℃处理10min，在温浴过程中，涡旋2~3次；
附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）
9）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，将含有洗脱DNA的液体转移到新的1.5ml的离心管中，用于进行qPCR反应。5.2 PCR反应体系
1）标准品、NTC和样品均做2个复孔；
2）反应母液用量按表4进行计算：
表4 PCR反应体系
Kit Reagents | Volume for 1 30-μl reaction（μl） | Volume for 36 30-μl reaction（μl） |
Negative Control | 2 | 72 |
10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix | 3 | 108 |
2×Environmental Master Mix | 15 | 540 |
DNA template | 10 | N/A |
合 计 | 30 | 720 |
5.3 PCR仪运行程序设置
5.3.1 PCR反应体系
1）标准品、NTC和样品均做2个复孔；
2）反应母液用量按表5进行计算：
表5 PCR反应体系
Kit Reagents | Volume for 1 30-μl reaction（μl） | Volume for 36 30-μl reaction（μl） |
Negative Control | 2 | 72 |
10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix | 3 | 108 |
2×Environmental Master Mix | 15 | 540 |
DNA template | 10 | N/A |
合 计 | 30 | 720 |
5.2.2 PCR仪运行程序设置
1）荧光基团选择FAM；
2）96孔反应模块设置见下表，样品根据实际数量依次设置：
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | SD1 | SD1 | 样品1 | 样品1 | ||||||||
B | SD2 | SD2 | 样品2 | 样品2 | ||||||||
C | SD3 | SD3 | 样品3 | 样品3 | ||||||||
D | SD4 | SD4 | ||||||||||
E | SD5 | SD5 | ||||||||||
F | SD6 | SD6 | ||||||||||
G | NTC | NTC | ||||||||||
H | ||||||||||||
附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）
3）PCR反应条件设置
步 骤 | 温 度 | 时 间（min:sec） |
1 | 95℃ | 10:00 |
2 | 95℃ | 0:10 |
3 | 60℃ | 0:30 |
4 | GOTO 2，39循环 | |
4）运行上述设置的程序。
6接受标准
1）标准曲线：扩增效率（E）：90%~130%；R2≥0.980；斜率（Slope）：
-2.7~-3.6。
2）样品数据：2个复孔测定值SQ的CV≤20%。
7结果计算与判断
外源性DNA残留量（pg/ml）=SQ×50，SQ代表测定平均值。
根据检测样品的蛋白质浓度，得出样品中每剂量所残留的外源性DNA量。
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