超声造影剂联合靶向药物在肝细胞癌临床前研究中的进展
言嫡婷1，彭秀达駕卢先州“
（1南华大学附属南华医院肝胆外科,2南华大学附属第一医院，湖南衡阳421000）
摘要：超声造影因其方便、可重复性操作、诊断率高等特点，在肝癌的诊断上具有重要价值。同时造影剂微泡本身还是一种良好靶向药物载体，使得超声造影除了诊断功能外还可能成为一种肝癌的新方法，这将是一项极具前景的研究。本文就最近几年有关于超声造影剂在肝细胞癌临床前研究中的新进展和局限性做一综述。
关键词：肝癌；造影剂微泡；靶向化疗；靶向基因表达
中图分类号:R735.7；R814.43文献标志码:A文章编号:1673-498X（2019）04-0075-04
doi:10.16500/jki.1673-498x.2019.04.024
肝癌是全球男性癌症死亡的第二大原因。肝癌的发病率及死亡率逐年上升。肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌类型，占全世界原发性肝癌的85%~ 90%［1-2］o目前公认乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）慢性感染、暴露、非酒精性脂肪性肝病等是其最常见的危险因素。我国一直以来都是肝
炎大国，目前乙肝携带者约占全国总人口的8%~10%，这也是我国原发性肝癌高发的原因之一。由于大部分患者肝癌早期症状不明显，等到发现时往往错失了手术的最佳时机。因此，目前除了传统手术切除外，还需要其他非手术方法来补充肝癌的⑶。超声造影是肝癌的重要诊断方法⑷，目前大量研究表明超声造影中使用的造影剂微泡能协同靶向肝癌药物的递送。因此，超声造影剂联合靶向药物在HCC的研究中被寄予厚望。
1超声造影剂
超声造影剂是一类包裹气泡的微小囊泡。根据包裹内容物的不同材料分为一代和二代。一代造影剂主要是采用变性的蛋白质、多糖以及各种表面活性剂包裹空气制作，其包膜较厚、弹性差且包裹物易溶于水，导致造影时效短，微泡稳定性差，因而一代造影剂目前临床应用少。二代造影剂主要采用的是小分子活性物质包裹高密度惰性气体为主，直径约2~5 Mm，微泡外膜薄软、不易溶于水或血液，稳定好、时效长、振动及回波效果好，所以目前临床上使用较多的是二代造影剂。2具有靶向HCC作用的超声造影剂
2.1靶向HCC造影剂的特征
在靶向HCC作用的造影剂研究中，除了要保留原造影剂的稳定性外，还要能协助靶向化疗药或基因的递送。目前使用的造影剂多采用脂质体等小分子物质作为外壳，包括：透明质酸（HA）%聚乳酸-乙醇酸
（PLGA）［7］、血管内皮生长因子（VEGF）［8］、磷脂酰肌醇聚糖-3⑼、聚乙烯亚胺（PEI）3、白蛋白M 等，然后内部注入惰性气体。这样的造影剂微泡即能降低传统化疗药物对机体的毒副作用，又能最大限度地阻止携带靶向基因的RNA在体内降解，特别适用于靶向基因的递送。
2.2靶向HCC造影剂的作用机制
对于靶向HCC造影剂的作用机制探讨，目前主要集中于以下几方面。超声靶向微泡破坏（ultra­sound—triggered microbubble destruction,UTMD）是指造影剂微泡本身可以在普通超声或者高能聚焦超声（high-intensity focused ultrasound,HIFU）辐照下引发机械振动，使微泡由小变大，当能量蓄积到一定程度使微泡破裂。特殊制备的微泡外壳内包含有靶向肝癌的药物或基因.UTMD能使靶向药物或基因精准释放。有研究观察到超声辐照还兼具高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect, EPR）"，^，这可能与超声辐照下对应部位的血管内皮细胞间隙增宽有关。这种效应能在一定程度上改变肿瘤微环境，使得包含靶向药物或基因的微泡更易
收稿日期：2019-09-16
基金项目：湖南省卫计委重大科研专项（A2017012）；湖南省教育厅科学研究重点项目（13A087）作者简介：言嫡婷，女，硕士研究生。
•通讯作者：卢先州，男，主任医师。
渗透入肿瘤组织内。二代造影剂微泡较一代微泡更具稳定性，有可能实现靶向药物或基因在肿瘤中的缓慢释放［⑵（图1）。还有研究表明超声辐照能在细胞膜表面瞬时打孔，进一步促进靶向药物或基因进入HCC细胞的胞质或胞核内。此外，超声辐照可能影响某些蛋白表达及信号通路的激活，如超声辐照促进活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的产生，激活凋亡蛋白中的天胱蛋白酶通路［⑶；也可能对Bax和Bel-2表达有调节作用，促进癌细胞的凋亡抑制肿瘤生长刚。
先制备好搭载靶向药物的超声造影剂，通过直接注射或者尾静脉注射将药物送达肿瘤细胞或组织内，后调整超声辐照功率，最终让微泡破裂释放药物。
图1超声造影剂递送靶向药物的部分作用原理
2.3HCC研究中的造影剂微泡分类
根据超声造影剂微泡是否含有靶向药物分为两大类:①微泡本身就包含有HCC的靶向化疗药或靶向基因，其优势是在UTMD下能使药物精准释放（以下简称为化疗药物微泡或靶向基因微泡）；②微泡与HCC的靶向化疗药或靶向基因的联用，即微泡本身不含有靶向药物或相关基因表达，而是二者同时接受超声辐照，此类造影剂微泡主要是提高化疗药物在HCC细胞中的递送率，以及过表达或敲低HCC相关基因的表达（以下简称为化疗药物+微泡或靶向基因+微泡）。根据微泡联用的靶向药物，也可大致分为两类:①传统化疗药物，如HCC患者中经常使用的阿霉素;②靶向基因所表达的各种RNA，如针对某些与肝癌表达
相关的shRNA、micRNA、LncRNA等。
231化疗药物微泡化疗药的选择上多以传统化疗药为主，如阿霉素［⑸、索拉非尼⑻、紫杉醇〔⑵等。
大部分实验主要围绕在阿霉素包裹于各种超声微泡外壳中开展。但是最近Zhao H等⑹在实验中制备出一种HA/CPPs-10-HCPT新型微泡（CPPs：细胞穿透肽,10-HCPT：径基喜树碱）。微泡中的HA通常在肿瘤组织中高表达且组织相容性好，同时10-HCPT常 规剂量小于阿霉素20倍，并且CPPs可以通过细胞膜进入细胞质或细胞核。因此实验中HA/CPPs-10-HCPT微泡能明显降低喜树碱对正常组织的毒性外，还能提高药物的稳定性和靶向性。因此，在HCC化疗药物微泡的研究中尝试多种化疗药物与造影剂微泡组合是必要的。
2.3.2靶向基因微泡特制的微泡外壳种类也与化疗药物微泡类似，不同之处在于靶向基因微泡的外壳
中包裹含有与HCC表达相关的RNA。众所周知，外源性的RNA进入体内后很快会被体内的各种酶所降解，几乎无法达到肝癌组织内部起效。因此，微泡外壳的包裹避免了所需目的基因的降解。在Mdlick Chowdhury S等的研究⑺中，将两种互补的micRNA （miRNA-122，反义miRNA-21）共同包封在聚乳酸轻基乳酸（PLGA）中，联合UTMD增强阿霉素抗性，为超声微泡对多种药物及基因联合协同作用提供了新的思路。但是此类微泡制备过程是最复杂的，在一定程度上限制其研究发展。
2.3.3化疗药物+微泡主要注重于传统化疗药的增敏作用。通过超声辐照在细胞膜表面的瞬时打孔，增强化疗药对HCC细胞的穿透力［⑹。此类微泡较化疗药物微泡更易于制备。在动物实验是通过体循环或者直接注射化疗药物和微泡到HCC肿瘤内部，再进行肿瘤局部超声辐照处理。但也应注意到其毒副作用较化疗药物微泡更大。因此，后期研究的可持续性有待考虑。
2.3.4靶向基因+微泡在造影剂研究中最常见。超声辐照微泡能提高各类siRNA的转染率，从而提高抑癌基因表达、或者敲低、沉默促癌基因的表达来促进HCC细胞凋亡。因此部分实验还仅仅停留在细胞实验层面，部分动物实验则需要避开体循环，直接在肿瘤局部注射。但是相比传统化疗药物，与HCC的发生发展有关的各种蛋白及这些蛋白上游调控的基因明显更丰富，如JNK-lshRNA”］、lncRNA-ATB［⑻、NET-lsiRNA^］、HIF-lshRNA［19］以及SOX9shRNA［20］Q
3小结和展望
超声微泡造影剂原本是为诊断B型超声中不明显的肿瘤所诞生的，所以它是一种诊断方式。由于近几年的超声设备、3D技术以及造影剂的更新换代，超声造影的诊断率几乎可以和增强CT、MRI相媲
美121-241o而超声的便捷，实时动态以及不受金属物干扰的优势是其它诊断方式所不能比拟的。造影剂即是一种良好的靶向HCC药物或基因的载体，也能协同靶向HCC药物的递送。因此，超声造影剂微泡联
合靶向药物或基因作为一种潜在HCC的新方法具有一定可行性。
目前所知的各类特制造影剂微泡在于HCC的实验中还只是处于在临床前实验，部分实验分组比较单一，联合效应有待提高，还需要大量的实验数据来推动造影剂微泡进一步的研究发展。造影剂需要多元化，个性化。针对不同的HCC类型和突变体，使用对应的靶向药物或基因，提高药物敏感度并降低耐药性。药物的搭配上尝试寻具有协同作用的最佳组合少]。应制定相应的超声辐照能量、药物的载药量、微泡包封率少]等指标的量化标准。在非手术手段上，应该力求多样化，扬长避短，相互补充。例如超声微泡前后，补充放疗⑴]、射频”叭微波[25等无创或微创的，甚至可以考虑腹腔镜直视下使用腹腔镜超声探头的靶向。一方面可以减少骨骼遮挡对于超声波能量的吸收，另一方面也减少呼吸运动造成组织移位的影响，提高肝癌瘤体定位的精准度。最后，还应该考虑到超声人员的技术差异问题。如何做好相关人员的操作统一性、高效性以及准确性还有待研究。相信在多学科的共同努力下，超声造影剂联合HCC靶向药物将推动肝癌的诊疗到达一个新的高度。
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