右美托咪定减轻酒精诱导的小鼠急性肝损伤
黄强;夏明珠;阳文杰;戴中亮;姜远旭
【摘 要】AIM:To investigate the effects of dexmedetomidine (DEX) on acute alcoholic hepatic injury in mice and to explore the possible mechanisms .METHODS:Kunming mice (n=50) were randomly divided into 5 groups (n=10):normal saline control (NS) group, acute alcoholic hepatic injury model (E) group, low-dose (10μg/kg) DEX (E+L) group, medium-dose (50 μg/kg) DEX (E+M) group and high-dose (100 μg/kg) DEX (E+H) group.The animals were sacrificed at 6 h after gavage of alcohol or normal saline .The levels of alanine aminotransferase ( ALT) , as-partate aminotransferase (AST), triglyceride (TG), malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) and superoxide dis-mutase ( SOD) were measured .The livers were removed for evaluation of histological characteristics and determining the content of tumor necrosis factor-α( TNF-α) amd interleukin-1β( IL-1β) in the liver tissues by ELISA .The expression levels of cytochrome P4502E1 (CYP2E1) and nuclear factor -κB (NF-κB) in the liver tissues were evaluated by Western blot.RESULTS:Compared
with NS group, the levels of ALT, AST and TG were obviously increased in E group , which were obviously decreased in E +M and E+H groups.Compared with NS group, the levels of TNF-α, IL-1βand MDA were obviously increase in E group , which were obviously decreased in E +M and E+H groups.Compared with NS group, the activity of SOD and the content of GSH were obviously decreased in E group , which were obviously increased in E +M and E+H groups.Compared with NS group, the expression of CYP2E1 and NF-κB was obviously increase in E group , which was obviously decreased in E +M and E+H groups.Compared with NS group , ethanol induced marked liver histo- logical injury, which was less pronounced in E +M and E+H groups.CONCLUSION: DEX has a protective effect on mouse liver with acute alcoholic injury by the involvement in the processes of antioxidation and antiinflammation , and its mechanism may be associated with the inhibition of CYP 2E1 and NF-κB expression.%目的:探讨右美托咪定(DEX)对酒精诱导的小鼠急性肝损伤的作用及机制.方法:50只昆明小鼠随机分为5组(n=10):生理盐水对照(NS)组、酒精性肝损伤模型(E)组、DEX低剂量(10μg/kg)(E+L)组、DEX中剂量(50μg/kg)(E+M)组和DEX高剂量(100μg/kg)(E+H)组.各组动物乙醇灌胃后6 h处死,采集血和肝组织
标本.测定各组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平以及甘油三酯(TG)浓度;测定各组肝组织丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;ELISA测定小鼠肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的浓度;Western blot检测肝组织细胞素P4502E1(CYP2E1)和核因子κB(NF-κB)的表达;HE染观察肝组织病理学改变并进行肝损伤评分.结果:与NS组比较,E组血清的AST、ALT水平及TG含量升高,与E组比较,E+M组和E+H组血清AST、ALT水平及TG含量降低;与NS组比较,E组肝组织MDA含量升高,GSH含量和SOD活性降低,与E组比较,E+M组和E+H组肝组织MDA含量降低,GSH含量及SOD活性升高;与NS组比较,E组肝组织TNF-α和IL-1β含量升高,与E组比较,E+M组和E+H组肝组织TNF-α和IL-1β含量降低;与NS组比较,E组肝组织CYP2E1和NF-κB表达升高,与E组比较,E+M组和E+H组肝组织CYP2E1和NF-κB表达降低;肝组织病理学检查可见,DEX中、高剂量可明显减轻肝细胞变性和坏死及炎性细胞浸润程度.结论:右美托咪定通过抗炎及抗氧化作用对急性酒精性损伤的肝脏具有一定的保护作用,其作用机制可能与抑制CYP2E1和NF-κB的表达有关.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2017(033)010
【总页数】5页(P1891-1895)
【关键词】右美托咪定;酒精性肝损伤;细胞素P4502E1;核因子κB
【作 者】黄强;夏明珠;阳文杰;戴中亮;姜远旭
【作者单位】深圳市人民医院麻醉科,深圳市麻醉医学工程研究中心,广东深圳518020;深圳市罗湖医院集团湖贝社区健康服务中心,广东深圳518020;深圳市人民医院麻醉科,深圳市麻醉医学工程研究中心,广东深圳518020;深圳市人民医院麻醉科,深圳市麻醉医学工程研究中心,广东深圳518020;深圳市人民医院麻醉科,深圳市麻醉医学工程研究中心,广东深圳518020
【正文语种】中 文
【中图分类】R575.1;R965
酒精性肝损伤常发生于过度饮酒者，严重者发展为酒精性肝硬化，5年生存率约为23%～50%[1]。酒精性肝损伤发病机制复杂，研究表明，氧化应激反应及其诱导的肝脏炎性反应在酒精性肝损伤中扮演重要角[2-3]。因此，减轻肝脏炎症和氧化应激是酒精性肝损伤的重要手段。
右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一种高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，由于具有良好的镇静和镇痛作用，近年来用于危重病人的镇静及术后需要机械通气的病人[4-5]。目前的研究表明，DEX具有抗炎和抗氧化作用，且对内毒素、肝缺血再灌注和急性肺损伤诱导的肝损伤有保护作用[5-9]。然而，DEX对酒精性肝损伤的保护作用及机制未见报道。本研究制备小鼠急性酒精性肝损伤模型, 以探讨DEX对酒精性肝损伤的保护作用及其可能的作用机制。
1 药物和试剂
盐酸右美托咪定注射液(江苏恒瑞医药公司)；天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒(RayBiotech)；抗细胞素P450 2E1(cytochrome P450 2E1，CYP2E1) 抗体(Abcam)；抗NF-κB和β-actin抗体(CST)。
2 方法
2.1 模型制作和分组 清洁级昆明种小鼠50只，4～5周龄，体重(20.0±2.0)g，雄性(购于广东省医学实验动物中心)。 实验前适应性喂养2 d，造模前禁食12 h，自由饮水。实验按体重随机分为5组，每组10只：生理盐水对照(NS)组(腹腔注射等体积生理盐水25 mL/kg，0.5 h后给予等热量、等体积糖水12 mL/kg灌胃)、酒精性肝损伤模型(E)组(腹腔注射等体积生理盐水25 mL/kg，0.5 h后给予50%乙醇12 mL/kg灌胃)、DEX低剂量(E+L)组(腹腔注射DEX 10 μg/kg，0.5 h后给予50%乙醇12 mL/kg灌胃)、DEX中等剂量(E+M)组(腹腔注射Dex 50 μg/kg，0.5 h后给予50%乙醇12 mL/kg灌胃)和DEX高剂量(E+H)组(腹腔注射DEX 100 μg/kg，0.5 h后给予50%乙醇12 mL/kg灌胃)。末次给药6 h后，腹腔注射3%钠50 mg/kg麻醉小鼠，麻醉后开腹，暴露下腔静脉，采集血标本，室温静置30 min,4 ℃、2 500×g离心10 min,取上清备用。放血处死动物，完整取出肝脏并称重。冰面上取部分肝右叶用10%中性多聚甲醛固定24 h后，用于病理学检查，取部分肝左叶液氮速冻后，-70 ℃冰箱冻存备用。
2.2 血清AST、ALT和甘油三酯(triglyceride，TG)水平的检测 取上述血清，严格按照试剂盒操作方法检测AST、ALT及TG水平。血清检测reactive是阴还是阳
2.3 肝组织TNF-α和IL-1β含量的检测 取冰冻肝组织解冻，ELISA检测TNF-α和IL-1β含量，严格按说明书操作。
2.4 肝组织MDA、GSH含量及SOD活性的检测 取肝组织100 mg解冻，制备肝匀浆用于测定肝组织中MDA、GSH含量和SOD活性。
2.5 肝组织CYP2E1和NF-κB蛋白表达的检测 取适量肝组织，用组织蛋白裂解液提取组织总蛋白，经过10% SDS-PAGE 分离后，电转移至硝酸纤维素膜上。室温下用含10%脱脂奶粉的TBST溶液对膜封闭2 h或过夜；封闭完毕后用PBST洗膜5次，每次间隔5分钟，洗膜后加入CYP2E1或NF-κB p65的 I 抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜；洗膜3次后，加入 II 抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔)，室温下孵育1 h，洗膜5次，每次间隔5 min，最后加入化学发光增强剂，自显影。采用图像分析处理系统对蛋白条带扫描分析，记录吸光度。结果表示为与对照组的相对吸光度。
2.6 肝脏病理学的观察 取上述10%中性甲醛固定的肝组织，常规石蜡包埋，切片，经HE染后观察肝组织病理学改变并进行病理学评分。肝组织评分标准如下：肝窦充血；门管区水肿；炎性细胞浸润；肝细胞坏死。分别依病情轻重评分(0分：无病变或非常轻微；1分：轻
度病变；2分：中度病变；3分：重度病变；4分：极重度病变)。各项评定分数相加为肝损伤总评分。
3 统计学处理
采用SPSS 13.0软件行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，Student-Newman-Keul q检验进行多重比较。组间比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
1 血清ALT、AST和TG水平的变化
与NS组比较，E组的ALT、AST及TG水平升高(P<0.01)；与E组比较，E+M组和E+H组的ALT、AST及TG水平下降(P<0.05)；与E+M组比较, E+H组的ALT、AST及TG水平下降(P<0.01),见表1。
2 肝组织MDA、GSH含量和SOD活性的变化
与NS组比较，E组的MDA含量增加(P<0.01)，SOD活性及GSH含量降低(P<0.01)；与E组比
较，E+M组和E+H组的MDA含量降低(P<0.01)，SOD活性及GSH含量升高(P<0.01)；与E+M组比较, E+H组MDA含量降低(P<0.01)，SOD活性及GSH含量升高(P<0.01)，见表2。
3 肝组织TNF-α和IL-1β含量的变化
与NS组比较，E组TNF-α和IL-1β含量增加(P<0.01)；与E组比较，E+M组和E+H组TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.01)；与E+M组比较，E+H组TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.01)，见图1、2。
4 肝组织病理学改变及肝损伤评分
NS组为正常的肝脏组织学结构，E组可见大量的炎性细胞及脂肪变性，与E组相比，E+H组炎性细胞及脂肪变性减少。与NS组比较，E组肝损伤评分增高(P<0.01)；与E组比较，E+M组和E+H组肝损伤评分降低(P<0.01)；与E+M组比较，E+H组肝损伤评分降低(P<0.01)，见图3。
5 肝组织CYP2E1和NF-κB的表达
与NS组比较，E组CYP2E1表达增加(P<0.01)；与E组比较，E+M组和E+H组的CYP2E1表达降低(P<0.01)；与E+M组比较, E+H组的CYP2E1表达降低(P<0.01)，见图4。
与NS组比较，E组的NF-κB表达增加(P<0.01)；与E组比较，E+M组和E+H组的NF-κB表达降低(P<0.01)；与E+M组比较, E+H组NF-κB表达降低(P<0.01)，见图5。
一次性暴饮建立的急性酒精性肝损伤模型由于造模周期短、易复制, 且与人类豪饮造成的肝损害一致, 是研究急性酒精性肝损伤发病机制的理想模型。本实验参照以往的研究复制急性肝损伤模型[10]。我们的研究发现，给予50%乙醇(4.8 g/kg)灌胃，可导致血液中ALT、AST和TG明显升高；病理学显示炎性细胞浸润，产生严重组织损伤，表明50%乙醇灌胃成功诱导急性肝损伤。本实验中，给予DEX 中、高剂量后，ALT、AST和TG降低，病理学改变减轻，表明DEX剂量依赖性减轻酒精诱导的急性肝损伤。
氧化应激在酒精性肝损伤中扮演重要角。酒精刺激后，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生是引起肝损害的重要因素[11]。过多的ROS通过损害DNA、蛋白变性等作用损害肝细胞。酒精诱导的ROS与多不饱和脂肪酸产生反应从而破坏细胞膜。在人体，ROS主要由SOD、GSH等酶类和非酶类抗氧化物质清除，以保持ROS浓度的平衡。MDA是
机体脂质过氧化的终末产物，间接反映出细胞损伤的程度[12]。我们的研究发现，与对照组相比，酒精导致肝组织SOD活性及GSH含量降低，MDA含量增加，而DEX能够增加SOD活性及GSH含量，降低MDA含量，表明抗氧化及减轻脂质过氧化反应是DEX减轻酒精导致肝损伤的机制之一。在肝脏,CYP2E1可被乙醇诱导并参与乙醇代谢，CYP2E1是一种有效的活性氧产生酶，产生超氧阴离子自由基和过氧化氢,是酒精导致的肝氧化应激的主要因素[13]。为了进一步探讨DEX抗氧化机制，我们观察了Dex对CYP2E1表达的影响。我们的研究发现，DEX抑制酒精诱导的CYP2E1表达，提示DEX的抗氧化作用可能与抑制肝细胞CYP2E1表达有关。

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