CRP 敲除通过介导Kupffer 细胞分化对大鼠血清
总胆固醇水平的影响*
刘芳英， 张雪娣， 王
帅， 黄长浩， 宋业鼎， 穆云萍， 李芳红， 赵子建△
（广东工业大学生物医药学院，广东 广州510006）
［摘
要］ 目的：研究C -反应蛋白（CRP ）基因全身敲除介导肝巨噬细胞［库普弗（Kupffer ）细胞］分化以及对
大鼠血清总胆固醇水平的影响。方法：利用TALEN 技术构建CRP 基因敲除大鼠模型，PCR 技术鉴定其基因型，筛选纯合子后代（纯合敲除为CRP -/-，野生型为CRP +/+），随机选择10只SPF 级雄性CRP -/-大鼠（8周龄）为模型组，10只SPF 级雄性CRP +/+大鼠（8周龄）为正常对照组。用Western blot 、RT -qP
CR 和免疫组织化学技术验证CRP 在CRP -/-大鼠重要脏器中的表达情况；胆固醇试剂盒检测大鼠血清总胆固醇水平；RT -qPCR 检测CRP -/-大鼠肝脏M1型巨噬细胞中CCL2、CCL3和IL -6表达水平，以及M2型巨噬细胞中IL -4、IL -10和转化生长因子β（TGF -β）表达水平；用分子生物学技术检测CRP -/-大鼠肝脏中M1型巨噬细胞标志物CD68、M2型巨噬细胞标志物CD163及胆固醇逆向转运（RCT ）关键蛋白B 族1型清道夫受体（SR -B1）的表达水平。结果：与CRP +/+大鼠相比，CRP -/-大鼠心、肝、肾、脾等重要脏器未检测到CRP 表达（P<0.01），表明CRP -/-大鼠模型构建成功。CRP -/-大鼠血清总胆固醇显著低于CRP +/+大鼠（P<0.01），肝脏中IL -6、CCL2和CCL3水平显著降低，而IL -4、IL -10和TGF -β表达显著增高（P<0.01）；M1型巨噬细胞标志物CD68表达水平显著下降，而M2型巨噬细胞标志物CD163表达水平显著上升（P<0.01）；CRP -/-大鼠肝脏内SR -B1水平显著高于CRP +/+大鼠（P<0.05）。结论：CRP 基因全身敲除影响Kupffer 细胞分化并降低大鼠血清总胆固醇水平，具体表现为：促进大鼠肝脏内单核细胞分化为M2型巨噬细胞，并抑制其向M1型巨噬细胞分化，显著促进
大鼠肝脏内RCT 从而降低大鼠血清总胆固醇。
［关键词］ C -反应蛋白；库普弗细胞；细胞分化；胆固醇逆向转运［中图分类号］ R364.5； R363.2    ［文献标志码］    A
doi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.06.009
Effect of CRP  knockout on serum total cholesterol level in rats via regu⁃lating Kupffer cell differentiation
LIU Fangying ， ZHANG Xuedi ， WANG Shuai ， HUANG Changhao ， SONG Yeding ， MU
Yunping ， LI Fanghong ， ZHAO Allan Zijian △
（School of Biomedical and Pharmaceutical Sciences ， Guangdong University of Technology ， Guangzhou ， 510006， China. E -mail ： azzhao@gdut.edu ）
［ABSTRACT ］ AIM ： To investigate the effect of systemic knockout of C -reactive protein （CRP ） gene on serum to‑
tal cholesterol level and the differentiation of liver macrophages （Kupffer cells ） in rats. METHODS ： The CRP  knockout rat model was constructed using TALEN technology ， and the genotypes were identified by PCR （hereafter CRP -/- for the knockout group and CRP +/+ for the wild -type group ）. Ten SPF -grade male CRP -/- rats （8 weeks of age ） were used as the model group ， with ten SPF -grade male littermate CRP +/+ rats （8 weeks of age ） as the normal control group. Further valida‑tion of CRP expression in the organs of CRP -/- rats was performed using Western blot ， RT -q
PCR and immunohistochemis‑try （IHC ） assays. Serum total cholesterol level was measured with a cholesterol kit. RT -qPCR was used to quantify the he‑
patic expression levels of chemokines CCL2 and CCL3， and inflammatory factor interleukin -6 （IL -6） in M1 macrophages. The expression levels of anti -inflammatory factors ， such as IL -4， IL -10 and transforming growth factor -β （TGF -β）， in M2 macrophages were also analyzed. The expression of CD68 （M1 macrophage marker ）， CD163 （M2 macrophage marker ），
and scavenger receptor class B type 1 ［SR -B1； the crucial protein of cholesterol reverse transport （RCT ）］ in the liver was ［文章编号］ 1000-4718（2023）06-1030-07
［收稿日期］ 2022-12-20  ［修回日期］ 2023-03-17 * ［基金项目］ 国家重点研发计划（No. 2018YFA0800603）；广东省重点领域研发计划“新药创制”专项（No. 2019B020201015）；广东省创新团队（No. 2016ZT06Y432）；国家自然科学基金青年项目（No. 82100064）；广州市基础与应用基础研究基金（No. 202201010167）
△通讯作者 Tel ：180****0698； E -mail ： azzhao@gdut.edu
·
·
1030
quantified by RT-qPCR，IHC and Western blot.RESULTS：Compared with CRP+/+rats，CRP gene was successfully knocked out in the liver，heart，kidney and spleen of CRP-/-rats （P<0.01）.The expression levels of IL-6，CCL2 and CCL3 were dramatically decreased in CRP-/- rats compared with CRP+/+ rats， while the IL-4， IL-10 and TGF-β expression levels were significantly up-regulated in CRP-/- rats （P<0.01）. In comparison to CRP+/+ rats， the expression level of CD68 showed a significant reduction， while CD163 was increased in CRP-/- rats（P<0.01）. The SR-B1 level was significantly higher in the liver of CRP-/- rats than that in CRP+/+ rats （P<0.01）.CONCLUSION： Deletion of CRP greatly enhances the RCT in the liver by driving Kupffer cells to differentiate into M2 macrophages while suppressing their maturation into M1 macrophages， thus reducing total cholesterol level in the knockout rats.
［KEY WORDS］C-reactive protein； Kupffer cells； cell differentiation； reverse cholesterol transport
C-反应蛋白（C-reactive protein， CRP）是正五聚蛋白家族的一员，在动物体内主要作为炎症标志物应答炎症反应［1］。在大鼠中，CRP主要由肝脏合成和分泌，当机体受到炎症等刺激时，肝脏迅速合成C
RP，并释放到循环系统发挥作用。肝脏巨噬细胞［库普弗（Kupffer）细胞］占体内总巨噬细胞的80%~ 90%［2］，巨噬细胞的特异性归因于不同免疫微环境下的应答状态与功能表型，即巨噬细胞的极化［3］。巨噬细胞在不同微环境和刺激因子的作用下可向不同方向极化，根据活化状态、功能及分泌细胞因子的不同，巨噬细胞主要可分为经典活化的M1型（促炎）和选择性活化的M2型（抗炎）［4］。M1型巨噬细胞可以由干扰素γ、脂多糖或巨噬细胞集落刺激因子诱导，高表达组织相容性复合物II类分子及共刺激分子CD80和CD68，上调诱导型一氧化氮合酶的表达，产生大量促炎细胞因子，如白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6和IL-12，同时产生趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、一氧化氮和活性氧等［5］。通过释放炎性介质，M1型巨噬细胞可以促进炎症反应，杀伤胞内感染的病原体。M2型巨噬细胞由IL-4、IL-10、转化生长因子β（transforming growth factor-β， TGF-β）、糖皮质激素等诱导，高表达CD163、CD206、CD200R、CD209、CD301、精氨酸酶1等，产生抗炎细胞因子如IL-10和TGF-β，参与免疫调节、组织重构和再生、伤口愈合、血管生成［6］等。然而，巨噬细胞的表型极化及功能是高度复杂的，目前对于巨噬细胞极化参与多种生化反应的作用仍无法解释。胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport， RCT）主要是血液循环中的高密度脂蛋白通过Kupffer细胞上的B族1型清道夫受体（scavenger receptor class B type 1， SR-B1）进入肝脏，水解后产生游离胆固醇，脂酰化为胆汁酸，随粪便排出［7］，进而降低血液中胆固醇酯浓度，这是维持体内胆固醇稳态的重要因素之一。SR-B1主要定位于肝脏由IL-10介导分化的M2型巨噬细胞上［8］。已有研究表明，CRP可诱导巨噬细胞集落刺激因子释放从而使巨噬细胞增殖，且呈一定的剂量依
赖性［9］，说明CRP诱导的巨噬细胞增殖可能是使单核细胞向M1型巨噬细胞分化增殖的重要因素。且有证据进一步说明CRP可以促使单核细胞向M1型巨噬细胞分化，还可抑制IL-4激化的M2表型［10］。
本研究拟采用基因工程手段构建CRP全身敲除大鼠模型，探讨炎症关键蛋白CRP对大鼠体内炎症微环境水平变化、Kupffer细胞分化及血清总胆固醇水平的影响。
材料和方法
1　实验动物
将SD大鼠通过转录激活因子样效应物核酸酶（transcription-activator-like effector nuclease， TALEN）技术（CYAGEN）进行基因敲除得到CRP敲除大鼠（纯合敲除为CRP-/-，野生型为CRP+/+）。随机选择SPF级雄性CRP+/+和CRP-/-大鼠各10只，体质量（350±20） g，8周龄。所有大鼠均饲养于华南理工大学动物实验中心［许可证号为SYXK（粤）2017-0178］屏障环境设施内，每笼2只，在温度和湿度受控的设施中，具有12 h的光/暗循环，随意获得水和食物。研究方案获得华南理工大学动物实验伦理委员会批准（No. 2020031）。2　主要试剂
CRP抗体（AF1744； R&D Systems）；CD68抗体（ab283654）、CD163抗体（ab182422）和SR-B1抗体（ab52629）购自Abcam；β-actin抗体（A2228； Sigma）；抗兔Ⅱ抗（111-035-003）和抗鼠
Ⅱ抗（115-035-003）购自Jackson ImmunoResearch；BCA蛋白定量试剂盒（23225）和ECL发光液（32106）购自Thermo Fisher；三溴乙醇和4%多聚甲醛（中国国药集团股份有限公司）；胆固醇试剂盒（YX-W-B409；江苏莱尔生物医药科技有限公司）。
3　主要仪器
DM500型正置显微镜和GN 300型RNA浓度测量仪（Leica）；T100型PCR扩增仪和ChemiDoc XRS+型化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad）；3107B-0411型qPCR检测仪（Analytik Jena）；5810R型低温离心机
·
·1031
（Thermo ）。4　实验方法
4.1　大鼠繁育　纯合敲除雌鼠与雄鼠合笼1 d 后，查看雌鼠是否有阴道栓，有则分笼，28 d 左右生下幼鼠，10 d 后剪下新生大鼠尾尖进行基因鉴定。20 d 离乳后，两只一笼喂养，饲养温度22~24 ℃，相对湿度60%~70%，给与自由饮食与饮水。4.2　大鼠模型建立　实验分为两组，每组10只，分别为8周龄雄性CRP +/+大鼠和CRP -/-大鼠，正常饮食喂养12周，每周定时进行体重记录，造模结束后禁食12 h ，
利用2.5%三溴乙醇（100 g/mL ）腹腔注射使大鼠安乐死。取肝左叶一部分−80 ℃冻存，用于后续的分子生物学实验，一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h ，用于后续制作石蜡切片。取大鼠全血于室温放置2 h 后，3 000×g 离心15 min ，取上清即得血清，冻于−80 ℃用于血清胆固醇测定。
4.3　Western blot 检测相关蛋白表达　取肝脏组织约0.1 g ，加入V RIPA ∶V PMSF ∶V 蛋白酶抑制剂∶V 磷酸酶抑制剂=1∶100∶50∶50的体系300 μL ，于冰上裂解10 min ，50 Hz 研磨20 s ，10 000×g 离心，冰上静置10 min 。取上清，用BCA 法检测蛋白浓度。以每孔30 μg 上样，电泳120 V 90 min ；转膜95 V 120 min ；5%牛奶封闭1 h 或4 ℃过夜后，Ⅰ抗（CRP 抗体，2 mg/L ；CD68、CD163和SR -B1抗体，1∶1 000；β-actin 抗体，1∶5 000）4 ℃过夜孵育，加入Ⅱ抗，显影。利用ImageJ 软件计算发光强度［11］。4.4　RT -qPCR  取肝脏组织约0.1 g ，使用Trizol 法提取RNA ，测定浓度后逆转合成cDNA 。进行qPCR ，用2−ΔΔCt 法计算mRNA 相对表达量［12］。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。
4.5　免疫组织化学　取肝脏组织石蜡切片，烘片1 h ，二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水，将柠檬酸钠抗原修复液（50×）稀释为1×，沸腾后将切片浸没，低温加热20 min ，自然冷却1 h ，内源性过氧化物酶强力封闭液封闭1 h ，5%牛血清白蛋白封闭1 h ，随后加入Ⅰ抗（CRP 抗体，1∶50；CD163、CD68和SR -B1抗体，1∶100），湿盒4 ℃避光过夜，复温30 min ，PBST 洗涤15 min ，加入对应HRP 标记的Ⅱ抗，DAB 显后，苏木素复染，在显微镜下观察选取视野拍照［13］。4.6　PCR  取大鼠尾尖0.05 g ，加
入组织裂解液，金属浴加热10 min 后，10 000×g 离心5 min ，取上清即得DNA ［14］。PCR 体系如下：Mix 10 μL ，ddH2O 8.8 μL ，引物（包括CRP -MF 、CRP -WF 和CRP -WTR1； 20 μmol/L ；由上海生工生物工程有限公司设计并合成，需要满足扩增区间在CRP 敲除的片段中，序列见表2）各0.4 μL ，DNA 0.4 μL 。PCR 程序如下：95 ℃ 90
s ；95 ℃ 30 s ，68 ℃ 30 s ，72 ℃ 30 s ，35个循环；72 ℃ 90 s ；4 ℃终止。
4.7　胆固醇试剂盒检测　调节酶标仪波长至500 nm ，蒸馏水调零。50 mmol/L 标准液用提取液稀释为2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25和0.078 mmol/L
的标准溶液备用，按照试剂盒添加各组分，最后添加大鼠血清，充分混匀，上机检测。5　统计学处理
所有实验数据均用GraphPad Prism 8.0进行统计分析，实验数据柱状图和图表数均以均数±标准差（mean±SD ）表示。数据经过正态分布和方差齐性检验后，两组之间采用t 检验，多组之间比较采用单因表1　qRT -PCR 引物序列
Table 1.　Sequences of the primer for qRT -PCR Name CRP IL -6IL -4IL -10CCL2CCL3CCL5CD68
CD163SR -B1Primer sequence （5´-3´）
F ： ACGCTACCAAGACGAGCTTTAAC
G R ： AGACTCCCAGGTGGCACAGATG F ： ACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTG
R ： TGGTCTGTTGTGGGTGGTATCCTC
F ： CAAGGAACACCACGGAGAACGA
G R ： TTCTTCAAGCACGGAGGTACATCAC F ： GGCAGTGGAGCAGGTGAAGAATG
R ： TGTCACGTAGGCTTCTATGCAGTTG F ： CTCACCTGCTGCTACTCATTCACTG R ： CTTCTTTGGGACACCTGCTGCTG F ： GACTGCCTGCTGCTTCTCCTATG R ： GATCTGCCGGTTTCTCTTGGTCAG F ： GACACCACTCCCTGCTGCTTTG
R ： CTCTGGGTTGGCACACACTTGG
F ： CTCTCTTGCTGCCTCTCATCATTG
G R ： GCTGGTAGGTTGATTGTCGTCTCC
血清检测reactive是阴还是阳F ： TTAGAATCACAGCATGGCACAGGTC R ： CCACAAGAGGAAGGCAATGAGAAG
G F ： TTCGTTTCCAGCCAGACAGG R ： TCGAGTCGTTCATCCCAACG
Product （bp ）146110941099412414710296132
F ： forward ； R ： reverse.
表2　PCR 引物序列
Table 2.　Primer sequence for PCR Name
CRP -MF
CRP -WTR1CRP -WF
Primer sequence （5´-3´）
TCACGATAAGCTTCTCTCAGGCTTCAT GACACACAGTGAAGGCTTCCAGTGGC TCACGATAAGCTTCTCTCAGGCTTTG
Reaction A
A+B B MF ： mutant forward ； WTR1： common primer ； WF ： wild -type
forward .
·
·1032
素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1　PCR鉴定大鼠基因型
首先对本实验室前期构建的全身敲除CRP基因大鼠进行合笼实验，大鼠幼崽剪尾消化后提取DNA，进行PCR基因鉴定。如图1所示，当在351 bp位置出现条带则为野生型大鼠，在365 bp位置出现条带
为纯合敲除大鼠，二者都有则为杂合大鼠（由于杂合大鼠各项检测指标在本研究中与野生型相比均无显著差异，故此文中不作论述）。
2　基因敲除大鼠CRP蛋白的表达情况
为了进一步确认CRP基因在大鼠中被成功敲除，对基因鉴定后的大鼠重要脏器组织进行分子生
物学检测。Western blot结果显示，全身CRP基因敲除大鼠的肝脏、心脏、肾脏及脾脏均无CRP蛋白表
达（P<0.01），见图2A；免疫组化和RT-qPCR结果显示，CRP-/-大鼠肝脏CRP蛋白和mRNA均无表达（P<
0.01），与Western blot结果一致，见图2B、C。上述结果表明，大鼠CRP基因全身敲除成功。
3　CRP敲除对大鼠体重及血清总胆固醇水平的影响CRP-/-大鼠体重、体重增长量及进食量均显著低于CRP+/+大鼠（P<0.01），见图3A、C；病理学检测结果显示，CRP-/-大鼠肝组织与CRP+/+大鼠相比无显著差异，均表现为肝细胞排列整齐且结构正常，见图3B；试剂盒检测结果显示，与CRP+/+大鼠相比，CRP-/-大鼠血清总胆固醇水平显著降低（P<0.01），见图3D。
4　CRP敲除对大鼠肝脏炎症微环境的影响
与CRP+/+大鼠相比，CRP-/-大鼠M1型巨噬细胞相关因子CD68、IL-6、CCL2和CCL3的表达水平均显著降低（P<0.01），见图4A；而M2型巨噬细胞相关细胞因子CD163、IL-4、IL-10及TGF-β的表达水平均显著升高（P<0.01），见图4B。
5　CRP敲除对Kupffer细胞分化的影响
免疫组化和Western blot结果显示，与CRP+/+大鼠相比，CRP-/-大鼠肝脏CD68表达水平显著下降（P<
0.01），而CD163表达水平显著上升（P<0.01），见图5
。
Figure 1.　Identification of CRP genotype in rats by PCR. WF：wild-type forward； MF： mutant forward.
图1
　大鼠基因型鉴定
Figure 2.　Expression of CRP protein and mRNA in various organs after knockout of CRP gene. A： no CRP protein expression was de‑tected in the liver， heart， kidney and spleen of rats after knockout of CRP gene （Western blot）； B： no CRP protein expres‑sion was detected in rat liver tissue after knockout of CRP gene （IHC， scale bar=100 μm）； C： no CRP mRNA expression was detected in rat liver tissue after knockout of CRP gene （RT-qPCR）. Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs CRP+/+ group.
图2　CRP基因敲除大鼠脏器中CRP蛋白和mRNA的表达
·
·1033
6　CRP 敲除对RCT 的影响
Western blot 结果显示，与CRP +/+大鼠相比，CRP -/-
大鼠肝脏SR -B1水平显著上升（P<0.01），免疫组化和RT -qPCR 实验亦得到相同的结果（P<0.05），见图6。
讨论
自1929年被发现，作为正聚蛋白家族中的一员，CRP 一直被认为是传统的炎症标志物，主要由肝脏合成和分泌，并在炎症反应进程中被释放到循环系统中［15-16］。多项研究表明，CRP 不仅作为炎症标志物存在，还参与了多个代谢调节环节［17］；Yang 等［18］发
现，全身性CRP 敲除大鼠高脂饮食诱导后，显示了对体重增加、胰岛素抵抗和慢性炎症的抗性，且能量消耗和胰岛素调节的葡萄糖代谢显著增强。这些表型反映了肥胖和2型糖尿病中CRP 水平的升高，并支持CRP 是代谢的直接调节者而不仅仅是代谢疾病标志物的假设。而CRP 具体如何调控胆固醇代谢、脂肪代谢与动脉粥样硬化进程有待深入探究［19-20］。
本研究结果也证实全身敲除CRP 这一关键的炎症基因后，大鼠肝脏内炎症微环境水平向抗炎水平倾斜，即肝脏内巨噬细胞主要分化为M2型巨噬细胞。虽然CRP -/-大鼠体重、
进食量及血清总胆固醇水
Figure 4.　Effects of  CRP  knockout on inflammatory microenvironment of the liver in rats. A ： the mRNA expression levels of pro -in‑
flammatory factors ， CD68， CCL2， CCL3 and IL -6； B ： the mRNA expression levels of anti -inflammatory factors ， CD163，
IL -10， IL -4 and TGF -β. Mean±SD. n=10. *P<0.05， **P<0.01 vs  CRP +/+ group.
图4　CRP
全身敲除对大鼠肝脏炎症微环境的影响
Figure 3.　Effect of CRP knockout on body weight and serum total cholesterol level in rats. A ： the body weight of the rats were moni‑
tored for 12 weeks ； B ： pathological changes of the liver were determined by HE staining （scale bar=100 μm ）； C ： food in‑take and body weight gain of CRP  knockout rats were significantly lower than those of wild -type rats ； D ： serum total choles‑
terol level in knockout rats was significantly decreased. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs  CRP +/+ group.
图3　CRP 敲除对大鼠体重及血清总胆固醇水平的影响
·
·1034

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。