百日咳是由百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）引起的一种严重急性呼吸道传染病，人普遍易感，尤以婴幼儿多见。近年来百日咳发病率有上升趋势，局部地区出现爆发或者流行，被称为百日咳再现［1-2］。值得注意的是，已接种疫苗的青少年和成人患百日咳的人数逐渐增多，其临床症状并不典型，其流行病学特征也发生了改变［3］，因此进行百日咳监测显得非常重要。本研究应用百日咳鲍特菌重复插入序列（Insertion Sequences, IS）481、IS1002双目标基因，结合羧基荧光素与小沟结合集团（5-Carbaxy Fluorescein-Aminohexyl Amidite-
百日咳鲍特菌双目标基因荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立及应用
刘勇，郭丽茹，刘鹏，黄海涛，张颖，高志刚，苏旭，陈锦英
（天津市疾病预防控制中心，天津　300011）
摘要：目的　建立以百日咳鲍特菌重复插入序列（Insertion Sequences481 and 1002，IS481，IS1002）双目标基因检测为特点的荧光定量聚合酶链反应（Polymease Chain Reaction，PCR） ，用于检测百日咳鲍特菌核酸，探讨在百日咳鲍特菌诊断中的应用意义。方法　针对百日咳鲍特菌的重复IS481及IS1002基因保守区域设计特异性引物、羧基荧光素与小沟结合基团（5-CarboxyFluorescein-Aminohexyl Amidite - Minor Groove Binder ，TaqMan-MGB ）荧光探针，做为双目标基因检测、筛选并优化荧光定量PCR 反应体系与反应条件，并通过体外克隆技术建立百日咳鲍特菌双目标基因定量分析模型。结果　引物与探针
的优化浓度分别为600毫摩尔/升（mmol/ L）和200 mmol/L ，与其他呼吸道菌均无交叉反应，具有良好的特异性。应用重组质粒绘制的标准曲线循环阈值（Cycle Threshold，Ct）与模板浓度具有良好的线性关系，方法检测灵敏度为102拷贝/微升（Copies /μl），标准曲线线性范
围为103～107 Copies /μl。用荧光定量PCR 检测50例百日咳病例标本，阳性45例，包括PCR方法检测阴性5份。
结论　建立的双目标基因实时荧光定量PCR 方法特异、敏感、快速，为百日咳鲍特菌的早期快速检测提供了技术支持。
关键词： 百日咳鲍特菌；双目标基因；荧光定量聚合酶链反应
中图分类号：R516.6  文献标识码：A  文章编号：1006-916X（2012）05-0447-04
Development and Application of a Real-Time Polymease Chain Reaction Method Based on the Duplex Target Gene for Detection of Bordetella Pertussis  LIU Yong, GUO Li-ru, LIU Peng, et al.（Tianjin Centers for Disease Control and Prevetion, Tianjin 300011, China）
Abstract :Objective　To set up a molecular diagnostic method for Bordetella pertussis based on the duplex target gene real- time polymease chain reaction（PCR）.Methods　The assay based on prime
rs and TaqMan-MGB probes were selected from highly conserved regions of the insertion sequence of IS481and  IS1002 of Bordetella pertussis. Optimized in reactive system and condition ,the duplex target gene fragment from pertussis was cloned into the T vector generated from pertussis as template was  set up to make the standard curve. Results　The best concent ration of primers and probe is 600 mmol/ L and 200 mmol/ L rspectively, with good conservatism and specificity none of the negative control sample showed falsepositive reaction in duplication. The standard curve indicated the linear relationship between cycle threshold and template concentration．The detection limit of the assay was 102 copies/μl. A linear standard curve was obtained between 103 copies /μl and 107 copies /μl，the assay was simple and good reproducibility， 45 sample showed positive reaction in 50 suspected cases. Conclusion　This realtime PCR assay provides a good method for quick and early detection to Bordetella pertussis．
Key words：Bordetella pertussis；The duplex target gene； Real-time polymease chain reaction
收稿日期：2011-10-09；修回日期；2012-06-08
作者简介：刘勇（1964-），男，黑龙江省密山市人，天津市疾病预防
控制中心副主任技师，硕士，从事免疫规划相关疾病检测工作。
Minor Croove Binder, TaqMan-MGB）荧光探针标记技术，建立了百日咳鲍特菌双基因荧光定量聚合酶链反应（Polymease Chain Reaction ，PCR）检测方法, 现将结果报告如下。
材料与方法
1　菌株和临床标本　菌种百日咳鲍特菌ATCC8467、支气管炎（败血）百日咳鲍特菌ATCC4617、肺炎链球菌、结核分枝杆菌由天津市疾病预防控制中心保存。临床标本来源于2010年在天津市监测采集的百日咳病例标本50份鼻咽拭子，包括普通PCR检测阳性的40份，阴性10份。2011年社区采集的非百日咳症状标本25份鼻咽拭子，-20℃冰箱保存。
2　引物和TaqMan 探针设计　参照Roorda 方法［4］，从美国基因数据库（GenBank ）上下载不同年代与地区的百日咳鲍特菌基因序列, 利用Oligo 6.0 软件进行同源性分析，在百日咳鲍特菌基因保守区域设计特异性引物和荧光标记探针。（1）IS481基因: 上游引物IS481F1：5′-ATGAGCTGGGCATCAAGCAC -3′，下游引物IS481R1：5′- GGTAGGTGTGAGCGTAAGC 3′，目的片段大小116个碱基对（Base Pair,bp）；荧光探针IS481P：5′-FAM-ACCTTACCGCCCACAGACCAAT-MGB（2）IS1002基因：上游引物为IS1002F：5′-CTAGGTCGAGCCCTTCTTGTTAAC -3′，下游引物IS1002R：5′-GCGGGCAAGCCACTTGTA -3′，目的片段大小111 bp；荧光探针IS1002P：5′-FAM-CATCGTCCAGTTCTGT-MGB。引物和探针均由Invitrogen 公司合成、标记并纯化。
3　核酸提取　采集的鼻咽拭子用法国梅里埃全自动核酸提取系统提取脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）。向1.5毫升（ml）离心管中剪入鼻咽拭子棉签部份，加入500微升（μl）自动提取仪配套裂解液（Lysis Buffer），再加20μl 蛋白酶K［20毫克（mg）/ml］溶液，56℃放置30 min后，样品液转到反应容器内放入自动提取仪中，按照仪器操作说明书进行程序设置，洗脱缓冲液设置为50μl。
4　荧光定量PCR检测体系优化　IS481和IS1002双目标基因分管检测，在Roche 480型荧光定量PCR仪上同时进行反应，设置反应参数相同。反应条件: 95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s， 40个循环，在60 ℃进行单点荧光检测。反应液: 2.5× PCR Real MasterMix 10μl，enhancer 1.25μl，IS481、IS1002引物浓度在100微摩尔/升（μmol/L）～800μmol/L，荧光探针浓度100μmol/L～400μmol/L，模板DNA 5μl，加双蒸水至终体积25μl。在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的循环阈值（Cycle Threshold，Ct）。优化条件选定原则：相同模板量下,Ct 值最小，荧光信号最强，若两者不一致优先考虑Ct值。
5　荧光定量PCR反应的特异性和重复性　（1）阳性标本
验证为：菌种百日咳鲍特菌、支气管（败血）百日咳鲍特菌、百日咳鲍特菌阳性样品、百日咳IS481重组质粒、百日咳IS1002重组质粒。（2）阴性标本验证为：呼吸道肺炎链球菌、结核分枝杆菌。选择百日咳鲍特菌3个稀释度同时进行5 个重复反应，通过变异系数（Coefficient of Variability, CV）
验证方法的稳定性。
6　质粒标准品的构建　以百日咳鲍特菌ATCC 8467 提取的DNA作为模板，分别以IS481F2 、IS481R2及IS1002F2、IS1002R2为引物分别进行PCR 扩增，其扩增片段长度分别为687 bp、 621bp。PCR产物纯化后，经与pCR2.1 载体连接并转化至大肠埃希菌。菌液提取质粒由Invitrogen 公司测序鉴定，进行浓度定量测定，并作为IS481及IS1002基因荧光定量PCR检测质粒标准品。
7　荧光定量PCR检测灵敏度　IS481及IS1002质粒标准品用双蒸水连续10倍稀释至107～101拷贝/微升（copies/μl）作为标准品模板，以双蒸水为阴性质控品，用上述荧光定量PCR 反应体系进行检测分析，根据反应体系中检测样品的浓度的对数和相应的Ct 值分别为X、Y 轴制作标准曲线，绘制标准曲线，构建细菌基因拷贝数定量分析模型，验证方法的灵敏度。标准曲线的斜率应为-3.1 ～-3.5。
结  果
1　荧光定量PCR反应条件的优化
荧光定量PCR反应条件的优化为探索引物与探针之间的最佳工作浓度，达到荧光信号强、噪音低、结果稳定的效果，以获得最低Ct 值和标准差（Standard Deviation. SD）小。本试验以提高反应的扩增效率与敏感度为标准，在相同浓度模板与反应体系中，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，结果表明，引物浓度为600mmol/L，探针浓度为200mmol/L时获得的Ct值最小（表1、2）。
2　方法特异性评价
2.1　百日咳IS481基因荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌、百日咳IS481重组质粒、百日咳鲍特菌阳性标本、支气管炎（败血）百日咳鲍特菌，出现特异性扩增曲线为阳性结果。阴性标本肺炎链球菌、结核分枝杆菌检测无特异性扩增曲线，结果均呈阴性。
2.2　百日咳IS1002基因荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌、百日咳IS1002重组质粒、百日咳鲍特菌阳性标本，出现特异性扩增曲线为阳性结果。支气管炎（败血）百日咳鲍特菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌检测无特异性扩增曲线，结果均呈阴性。
经过荧光定量PCR 检测确认，只有百日咳鲍特
菌、百日咳鲍特菌阳性标本为IS481和 IS1002双基
因阳性，阴性标本肺炎链球菌、结核分枝杆菌双基因阴性。
3　定量分析模型和标准曲线的建立
对每个反应体系含模板数分别为107～101
copies/μl 的IS481及IS1002质粒标准品进行荧光定量PCR 检测分析，在Ct 值36以内得到方法的检出限约为102copies/μl 。选择107copies /μl ～103copies/
μl 反应5 点，以质粒拷贝数的对数
（lg Copies ，lgC ）与反应Ct 值制作标准曲线，得到标准曲线方程为：IS481基因检测标准曲线Y= -3.324X + 45.82，即斜率在-3.324 （图1）；IS1002基因检测标准曲线Y= -3.225X + 43.31，即斜率在-3.225 （图2） 。IS481和IS1002双基因荧光定量PCR 标准曲线的斜率均在-3.1 ～-3.5，
在标准范围内。
图1　荧光定量PCR 方法检测百日咳IS481基因扩增标准曲线Figure 1　
Standard Curve for IS481 Genomic Copy Quantification
图2　荧光定量PCR 方法检测百日咳IS1002基因扩增标准曲线Figure 2　Standard Curve for IS1002 Genomic Copy Quantification
4　方法重复性评价
选择不同稀释度的3 个标本进行定量PCR 检测，每个样本重复5 次，通过计算同一样本Ct 值的差异来验证方法的准确性（表3 ） 。CV 在合理范围内（＜2％），可以得出结论, 构建的荧光定量PCR 检测方法具有良好的可重复性，为定量分析奠定了基础。
表1　IS481基因引物与探针浓度的筛选结果（ Ct 值）
Table 1　IS481 Test Analysis for Primers and Probe
Concentration Optimization （ Ct ）
探针浓度
Probe Concentration （mmol/ L ）
引物浓度Primers Concentration （mmol/ L ）100
200
400
600
800
10026.0826.4125.9325.1725.6120026.0026.2325.8124.6625.2830025.9526.1125.9825.9625.93400
26.03
26.32
26.41
25.83
26.08
reactive阳性是什么
表2　IS1002基因引物与探针浓度的筛选结果（ Ct 值）Table2　IS1002 Test Analysis for Primers and Probe
Concentration Optimization （ Ct ）
探针浓度
Probe Concentration （mmol/ L ）
引物浓度  Primers Concentration （mmol/ L ）100
200
400
600
800
10030.9730.5229.9529.2129.5320030.7830.1929.8028.7529.3130031.1830.4030.0029.6629.72400
31.26
30.32
30.13
29.85
30.15
表3　荧光定量PCR 方法检测百日咳的重复性实验结果
Table 3　Reproducibility Test for Bordetella Pertussis Real -Time  PCR
样本号No.of Sample
Ct1Ct2Ct3Ct4Ct5平均值Mean Value
SD CV （％）125.1925.8525.5826.2325.9526.320.42  1.62223.9124.5323.8224.1223.7424.020.28  1.173
30.29
31.77
31.03
31.79
31.13
31.20
0.55
1.78
5　临床标本的检测
普通PCR方法检测阳性的40份标本，用荧光定量PCR 检测仍为阳性，并且Ct值在15～29，25以内为多。普通PCR方法检测阴性的10份标本中，有5份用荧光定量PCR 检测为阳性，Ct值在30～35，为抗百日咳毒素免疫球蛋白G（Antibody to Pertussis Toxin Immunoglobulin G，Anti-PT-IgG）检测
阳性标本。荧光定量PCR 检测判断为阳性的标本均为双基因阳性，无IS481或者IS1002一阴一阳结果。对25份非百日咳标本进行检测，以百日咳鲍特菌做阳性对照，有特异性扩增曲线，为阳性结果。以水做阴性对照，25份标本无特异性扩增曲线，结果均呈阴性。说明本方法具有高度的检测灵敏度和特异性。
讨  论
国内检测百日咳鲍特菌的方法主要是普通PCR，引物主要针对百日咳鲍特菌IS481基因，百日咳毒素基因启动子区域为靶基因。定性PCR容易污染，无荧光定量PCR 特异性强，现在荧光定量PCR 为发展方向。IS481在百日咳鲍特菌全基因组中的拷贝数＞200个，检测灵敏度高，在百日咳鲍特菌的检测中多被用到。但感染人类呼吸道的不同鲍特菌属之间存在遗传基因的高度相似性，近些年来，Reischl［5］和Karen［6］先后都发现，霍氏百日咳鲍特菌和支气管（败血）百日咳鲍特菌中存在类似IS481的成分，并能够引发百日咳样症状，故单独使用IS481作为目标基因检测百日咳鲍特菌的方法，很难对阳性结果做出准确解释。IS1002是百日咳鲍特菌除IS481以外的另一段特异性重复插入序列，并只存在于百日咳鲍特菌和感染人类的副百日咳鲍特菌基因组中。由于副百日咳鲍特菌中尚未发现IS481序列，只有百日
咳鲍特菌同时具备IS481和IS1002 ，因此选择IS481和IS1002 为靶基因，设计百日咳鲍特菌荧光定量PCR检测，用引物和荧光标记探针，通过对百日咳鲍特菌阳性和阴性标本的检测证明了特异性。
本次荧光探针标记使用高效TaqMan-MGB 标记方法。 TaqMan-MGB为非荧光物质，在猝灭报告基团的同时，自身并不会发射荧光。相对国内较多用于病原体检测的荧光探针猝灭基团为5-羧基四甲基罗丹明（5-Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA）而言，TaqMan-MGB荧光本底低，猝灭效
果更好，具有良好的信噪比，检测灵敏度更高。本分析以PCR为主要标准，荧光定量PCR检测阳性标本未全部经过序列分析和细菌分离培养验证，结果有局限性。未来将增加细菌分离培养做金标准佐证，并在随后的百日咳监测中用大量标本进行验证。
用本研究建立的双目标基因荧光定量PCR 方法，对送检的百日咳病例标本检测结果表明，普通PCR方法检测阳性的标本，荧光定量PCR检测Ct 值均较小，大部分在18～25，在1h内可看到结果，比普通PCR方法扩增后再需经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统仪进行图像分析，可减少几个小时时间，为快速诊断提供保证。普通PCR方法检测阴性标本，用荧光定量PCR 检测出阳性，为Anti-PT-IgG 检测阳性标本，Ct值在30～35比较高。提示受病程和抗生素使用的影响百日咳菌含量相对低，应用较高灵敏度荧光定量PCR 才可检测出标本中的百日咳鲍特菌。本研究建立的百日咳双目标基因荧光定量PCR 方法可以准确、快速地进行百日咳菌的早期诊断，将对于百日咳及时和监测起到重要作用。
参考文献：
［1］C rowcroft NS, Booy R, Harrison T, et al. Severe and unrecognised: pertussis in UK infants［J］. Arch Dis Child, 2003, 88（9）: 802-806.［2］N icholas W,Peter M. Pertussis: review of epidemiology, diagnosis, management and prevention［J］. Paediatr Respir Rev J, 2008, 9（3）：201-211．
［3］张颖，黄海涛，刘勇，等. 天津市社区人百日咳发病监测及传播特征研究［J］.中国疫苗和免疫（Chinese Journal of Vaccines and Immunization），2011,17（3）：209-211．
Z HANG Ying, HUANG Hai-tao, LIU Yong, et al. Incidence surveillance of Pertussis Based on Community and Analysis of Its Transmitted Features in Tianjin［J］. Chinese Journal of Vaccines and Immunization, 2011, 17（3）：209-211．
［4］R oorda L, Buitenwerf J, Ossewaarde M, et al.A real-time PCR assay with improved specificity for detection and discrimination of all clinically relevant Bordetella species by the presence and distribution of three Insertion Sequence elements［J］ .BMC Res Notes, 2011, 1（4）： 11-14．
［5］R eischl U，Lehn N，Sanden G ，et al.Real-Time PCR Assay Targeting IS481 of Bordetella pertussis and Molecular Basis for Detecting Bordetella holmesii［J］ .J Clin Microbiol， 2001， 39（5）: 1963-1966．
［6］K aren BR， Gary NS，et al.Prevalence and Sequence Variants of IS481 in Bordetella bronchiseptica: Implications for IS481-Based Detection of Bordetella pertussis ［J］. Clin Microbiol, 2006， 44（12）: 4577-4583．

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。