线粒体DNA异常与肿瘤的相关性（精选文档）
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线粒体DNA异常与肿瘤的相关性
龙廷综述
摘要：线粒体DNA（mtDNA）是真核细胞中唯一独立于核DNA之外的遗传物质，其特殊的环境、结构与功能以及在肿瘤细胞中所表现出的高比率异常，提示mtDNA与肿瘤发生之间存在密切的相关性。mtDNA异常与肿瘤之间的相互关系及其作用和调控机制仍是当前研究热点。
关键词：线粒体DNA，肿瘤
线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是真核细胞中唯一存在的独立于核DNA之外的遗传物质，被称为“人类第25号染体”。近年来在多种肿瘤组织中相继发现了线粒体DNA 异常，而且线粒体DNA 的突变率明显高于核基因，目前趋向认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质，而且与核外线粒体DNA密切相关，线粒体DNA异常可能参与肿瘤发生。
1 线粒体DNA的结构与功能特点
Aderson等人于1981年首先完成对人类mtDNA全序列的测定[1]。mtDNA是一条全长16569bp的双链闭环分子，一条为重链（H链），含较多鸟嘌呤，是12S和16S rRNA基因、14种tRNA基因及12种蛋白多肽基因的模板，另一条为轻链（L链），含较多胞嘧啶，是8种tRNA基因和1种蛋白多肽基因的模板。mtDNA基因组内编码的13种蛋白多肽分布为：复合体Ⅰ（NADH-泛醌还原酶，NADH dehydogenase-uˉbiquinene oxidoreductase，ND）中7个亚基（ND 1 ，ND 2 ，ND 3 ，ND 4 ，ND 4L ，ND 5 ，ND 6 ）；复合体Ⅲ（泛醌-细胞素C还原酶，ubiquinone-cytodhrome c oxidoreductase）中1个亚基（Cytb）；复合体Ⅳ（细胞素C氧化酶，cytochrome c oxidase，CO）中3个亚基（COⅠ，COⅡ，COⅢ）和复合体V（ATP合酶，A TPsynthase）中2个亚基（ATPase6和ATPase8）。以上13种多肽均是呼吸链的组成成分。mtDNA相邻基因间极少有非编码基因，D环（D-Loop）区是mtDNA的主要非编码区，位于16028bp-577bp，约占全部mtDNA的6%（约1120bp），富含A-T碱基，包括3个高变区：16024-16324bp为高变区Ⅰ（HVⅠ），63-322bp为高变区Ⅱ（HVⅡ），438-574bp为高变区Ⅲ（HVⅢ）。D环区有mtDNA复制的起始位点和转录启动子，对mtDNA复制和转录具有调控作用。mtDNA可独立于核DNA之外自主地进行复制、转录和翻译，具有非常活跃的自我复制能力。mtDNA的基因结构全部是外显子，没有内含子，散发的DNA突变通常就可导致DNA序列的改变，造成蛋白质表达的变化。
2 导致线粒体DNA异常的主要因素
mtDNA结构简单，缺乏组蛋白和非组蛋白保护，环境特殊，处在活性氧及其他自由基包围之中；mtDNA分子量小，无内含子，在整个细胞周期中处于不断合成的状态，而负责mtDNA复制的DNA聚合酶γ校对能力差，而且mtDNA由D环区单链启动复制，容易在tRNA基因部位出现发夹样结构，mtDNA还缺乏有效的损伤修复系统，因此，mtDNA易受各类诱变因素作用而发生损伤和异常，其突变率比核DNA高10-20倍[2]。
2.1 ROS氧化损伤
在可能导致mtDNA突变的环境有害因子中，研究较多的是活性氧（reactive oxygen species，ROS）。mtDNA位于线粒体基质内，并靠近内膜电子传递链，直接暴露于线粒体内高氧环境，人体内90%以上
的氧消耗直接与线粒体的呼吸链相联系，线粒体在呼吸链代谢中产生超氧粒子，在电子转运过程中生成的大量ROS以及过氧化物，线粒体本身不能合成谷胱甘肽将过氧化物有效清除，因此，当ROS产生过多或抗氧化防御系统作用减弱时，线粒体内氧自由基容易出现累积，可诱发mtDNA点突变，点突变可提高DNA双链的分离机会，促使mtDNA进一步发生核酸大片断丢失、断裂、碱基修饰和插入等不同形式的变异[3]。
2.2 致癌物结合
mtDNA与富含脂质的线粒体内膜相连，线粒体内脂肪/ DNA 的比值较高，使mtDNA 对脂溶性化学物质非常敏感，并往往成为亲电子物质首选的靶点，具有嗜脂性的致癌物往往优先在mtDNA上聚集。在用亲脂肪硫氰酸MKT-077 体外处理肿瘤细胞与正常细胞的实验中, 结果表明在两种细胞中，MKT-077 与mtDNA 的结合量均显著高于与核DNA的结合量[4]。用同样的方法，以14C标记多种化学致癌剂体外处理培养细胞，一致表明致癌物与mtDNA的结合率相对核DNA高：烷化类致癌剂与mtDNA 的结合率是核DNA的5倍；苯并芘与mtDNA的结合率为核DNA的40-90倍；多环香烃与mtDNA的结合率为核DNA的50-500倍；B1与肝细胞mtDNA的结合率是核DNA的3-4倍，而且这些结合不易消除，可在线粒体内持续存在24h 以上。mtDNA 与致癌剂共价结合的反应产物是7-甲基鸟嘌呤，常导致mtDNA 链断裂。
3 肿瘤细胞的线粒体DNA异常
根据近10年来的文献报道，在人类多种实体瘤，包括头颈、食管、乳腺、肺、胃、肝脏、胰腺、结肠、肾、膀胱、前列腺和卵巢等处的恶性肿瘤细胞中均发现mtDNA突变或表达异常，在血液系统恶性肿瘤中也发现mtDNA异常，如白血病患者肿瘤细胞中存在特异性的mtDNA环状二聚体结构[5]。肿瘤细胞的mtDNA异常主要表现为：
3.1 mtDNA突变
研究显示不同组织发生的肿瘤mtDNA突变位点、突变形式和突变程度并不一致，这可能是由于不同的组
织肿瘤发生所必需mtDNA突变率、线粒体的数目和细胞分化固有的数目存在差异[6]。已报道的肿瘤mtDNA突变类型多数为单碱基替换（从T→C和G→A），而且D环区是体细胞mtDNA突变的频发位点[7]。现就研究较多的消化系统肿瘤mtDNA突变特点作一简介：
Polyak等于1998年首次通过对10例结肠癌细胞系和原发性肿瘤中mtDNA全基因组测序，发现了7例（70%）伴有mtDNA体细胞同质性突变。在12种突变形式中，有11/12是单个碱基的替换，1/12是插入突变，实验还发现mtDNA的突变比核DNA突变至少多10倍[8]。Habano等在45例结肠癌组织中发现有7/45（16%）存在mtDNA突变，包括3例编码区ND1和ND5的移码突变，2例错义突变，1例15bp的缺失，没有发现大片段的缺失[9]。在对胃癌组织的研究中，相关结果显示胃癌可能更倾向于发生mtDNA大片段的缺失，这与结肠癌多倾向于点突变的发生有所不同。Maximo等发现在32例原发胃癌病例中有17例（53%）存在mtDNA4977bp大片段的缺失，突变大多发生于D环区和ND1、ND2区[10]。Burgart等对32例胃腺癌mtDNA进行突变检测，发现4/32（12.5%）例D环区存在50bp的缺失[11]。Habano研究了胃癌患者的8个编码基因和D环非编码的（C）n序列，发现有ND（ND1、ND5）基因的突变[12]。Hiyama等检测了56例胃癌患者肿瘤组织中的mtDNA，结果发现有9例（16%）存在mtDNA的突变，而且在癌组织中mtDNA的突变率明显高于非癌组织（12%vs1%），差异有显著性（P=0.008）[13]。上述证据表明，胃肠道肿瘤组织中mtDNA的突变情况是不一致的。mtDNA中的D环区紧靠电子传递链，而且D环区是mtDNA复制转录的调控区，由此可推测D-环区可能是mtDNA突变
的热点区域，而许多报道也支持了这一假想：Nishikawa等对59例肝癌肿瘤组织及相应的癌旁组织中mtDNA进行检测，结果发现在D环区的100～600bp的碱基之间突变频率最高，所有突变均为260bp 处G→A，489bp处T→C的单碱基替换，以及311→312bp之间的C插入[14]。另外，Nomoto等检测了19例肝细胞癌患者的肿瘤组织，发现有13/19（68%）例存在mtDNA D环区的突变[15]。Okochi等对50例肝细胞癌病人进行了检测，结果在肿瘤组织中发现的100处基因变异中有17/50例（34%）发现了D 环区的突变，并且在随后的匹配血浆检测中，有5/15例（33%）在其相应的血浆中检测到了一致的mtDNA 突变[16]。
3.2 线粒体微卫星不稳（mtMSI）
人类基因组中微卫星DNA不仅位于核基因组，也存在于线粒体DNA中，约占基因组的10％。迄今线粒体基因上累积的多态性位点（表现为不稳定性）接近1000个，其中D环区的多态性位点多达400余个。肿瘤细胞呈现的线粒体微卫星不稳定（Mitochondrial Microsatellite Instability，mtMSI）或线粒体基因组不稳定（Mitochondrial Genome Instability，mtGI）形式以D环区的（CA）n和polyC不稳定最为常见。出现mtMSI的原因可能是活性氧的破坏、滑链错配和不平衡交换，16189位点的碱基替换也可能导致polyC长度不稳定。
Habano等对62例胃癌细胞核和线粒体微卫星不稳定性的检测表明，16％（10/62）表现为mtMSI （poly
C不稳定），5例编码区基因发生突变者有4例合并mtMSI表型，并发现mtMSI与核微卫星（nMSI）不稳定呈正相关[9]。不过，Maximo等的研究结果提示mtMSI和nMSI并无相关关系，MSI与mtDNA 编码区突变无密切关系[10]。凌贤龙等对30例胃癌进行检测，检出mtMSI 11例（36.7％），反映出胃癌mtMSI是常见现象，实验还发现，在浅表性胃炎→萎缩性胃炎→胃癌前病变→胃癌的过程中，mtMSI 有增加趋势，mtMSI发生于胃粘膜癌变的早期阶段，提示mtMSI可能与胃癌发生发展有关[17]。此外，Jeronimo等检测16例前列腺癌，发现3例存在mtDNA多位点突变，同时呈现高频率mtMSI[18]。reactive翻译
3.3 mtDNA数目、转录和表达水平变化
有研究发现，神经胶质瘤细胞mtDNA的拷贝数明显较正常细胞增多，所有急性白血病和大部分慢性白血病患者的mtDNA也显著增加。Simonnet等对25例肾肿瘤（包括肾嗜酸性细胞瘤，肾细胞癌透明细胞型和嗜酸细胞型）组织中的线粒体酶、mtDNA以及氧化磷酸化蛋白含量进行检测，结果显示，mtDNA的损伤与肿瘤的侵袭性呈正相关，肾嗜酸细胞瘤细胞中，三项指标较恶性肿瘤高3-4倍，而复合体Ⅴ在肾肿瘤细胞中的含量均下降[19]。肿瘤细胞mtDNA数目增加可能与mtDNA复制失控有关，胡义德等提出，T碱基突变可降低GC含量，削弱复制起始区双键之间的结合力，引起mtDNA复制启动易化[20]。不同癌组织中出现转录水平改变的线粒体编码区基因并不一致，例如：在人结肠腺癌细胞系HT-29中，ND4、ND4L、cytb、COXⅢ、ATPase6、A TPase8以及16srRNA的转录水平增高，但在乳腺癌组织中，ND2、ND4、A TPase6的表达并未发生变化，仅COXⅡ表达增加[21]。
4 线粒体DNA异常参与肿瘤发生的可能机制
4.1 mtDNA突变导致细胞氧化应激和细胞凋亡抑制从而诱导肿瘤发生
理化、生物等外源性致癌物和氧自由基等内源性损伤因子引起的mtDNA突变，无论是发生在D环非编码区还是编码区，都将间接或直接影响线粒体电子传递链的氧化磷酸化系统，最终导致持续的细胞氧化应激而促进肿瘤发生和发展。肿瘤细胞中mtDNA 发生突变与肿瘤细胞内高水平的ROS是一致的，各种原因引起mtDNA 突变导致呼吸链代谢障碍，削弱正常呼吸功能，释放高水平ROS，ROS又可导
致新的突变发生，形成恶性循环。ROS可以对细胞成分包括核基因组(如癌基因和抑癌基因) 造成损伤，可以促进nDNA 突变和细胞分裂，使细胞获得选择性增生的优势。在一些线粒体基因组中，生命进程中突变的mtDNA 逐渐积聚直至起主导作用时，可引起氧化磷酸化功能缺失，尤其在能量需求较高的脑和骨骼等组织，可出现与代谢相关的遗传病和衰老，包括引发早期癌症。肿瘤发生机制之一是细胞凋亡受阻而永生化，而线粒体在细胞凋亡调控中起重要作用。mtDNA突变导致线粒体功能异常，释放的激活凋亡诱导因子Caspase3家族的蛋白酶和细胞素C减少，细胞凋亡受到抑制，而高ROS还引起Bcl-2和Bcl-X L的过表达并增强其抗凋亡作用，相反促凋亡蛋白Bid和Bax表达下降，从而诱导肿瘤发生。
4.2 mtDNA突变的非随机分离引起恶性转化
各种损伤因子首先导致少量异质性mtDNA突变，异质性细胞在连续分裂的过程中会出现突变型和野生型的比例改变，如果突变使得细胞获得生长或是mtDNA复制的优势，例如mtDNA突变导致线粒体功能缺陷，只有过多复制使之从数量上增加才能获得补偿，致使异质性mtDNA突变具有选择性的生存优势，逐渐取代野生型mtDNA并最终转变为同质性，异质性mtDNA突变积累到一定程度则导致细胞向恶性转化及肿瘤发生[22]。
4.3 mtDNA分子及其片段在核基因组中整合
细胞内受损伤线粒体在短期内大量崩解产生的游离mtDNA及其片段，以及一部分线粒体RNA在胞质中逆转录成的mtDNA，可类似致瘤病毒，通过核膜，随机整合到核DNA（nDNA）中。对Hela TG 细胞的研究发现，mtDNA的细胞素氧化酶亚单位Ⅲ(CoⅢ) 基因在核基因组中发生整合，整合位于c-myc基因组内。整合后使细胞产生了融合的mRNA，不仅含有来自c - myc 遗传信息而且含有CoⅢ的遗传信息。这一发现提示mtDNA在nDNA内的整合可能是诱发细胞癌变的重要机制之一[23]。mtDNA 在nDNA内的整合可能通过两条途径引起细胞癌变：①通过引起核基因组的不稳定性发生癌变；②通过改变细胞能量产生，提高线粒体氧化压力，引起线粒体酶表达异常和/或调控凋亡等途径来影响细胞的生物学行为，使其发生恶变。
5 问题
尽管越来越多的证据支持mtDNA异常具有致病性，在肿瘤发生机制中起重要作用，mtDNA突变和mtMSI作为肿瘤非侵入性临床诊断的分子标记物也得到了广泛的支持，但迄今为止mtDNA与肿瘤之间相关性的研究还仅局限于对mtDNA改变的检测和对可能机制的推测，而且不同部位的实体性肿瘤中mtDNA的突变和不稳定性不很一致，因此，尚无法在整体水平上分析它们之间的关系和规律。
对现有研究结果，不少学者也提出了质疑：mtDNA 突变可能只是一个随机事件，与肿瘤发生无关，而D310区（实体瘤突变热点）的插入或缺失突变可能仅反映了D环区的高变性（多态性），并不一定表明存在线粒体微卫星不稳。Polyak在结直肠癌的细胞系中发现的mtDNA 的高突变率，可能是体外培养的肿瘤细胞的持续进化对mtDNA产生了比对nDNA 更为严重影响的结果。
Antonio Salas和他的同事最近在PLoS Medicine发表了一篇题为“A Critical Reassessment of the Role of Mitochondria in Tumorigenesis”的论文[24]，他们从“系统发生学”的角度，利用基因数据库，对近年著名国际学术期刊上发表的阐述mtDNA与肿瘤发生相关性的论文中的mtDNA测序结果进行了严格比对，结论是：论文中所有的mtDNA异常证据存在明显的错误，根据他们的分析，提供mtDNA测序的样品要么是受污染的要么是混合物，不能体现mtDNA在肿瘤发生中的作用。目前对这一结论仍在争论中，至少它对探究mtDNA与肿瘤相互关系提出了更高的要求。

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