第 32 卷 第 8 期Vol.32，No.8202-2132023 年 8 月
草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA 孙守江， 毛培胜， 豆丽茹， 等. 活性氧及染体端粒调控种子老化研究. 草业学报， 2023， 32（8）： 202−213.
SUN Shou -jiang ， MAO Pei -sheng ， DOU Li -ru ， et al . Studies on the regulation of seed aging by reactive oxygen species and telomeres. Acta Prataculturae Sinica ， 2023， 32（8）： 202−213.
活性氧及染体端粒调控种子老化研究
孙守江，毛培胜*
，豆丽茹，贾志程，孙铭，马馼，欧成明，王娟
（中国农业大学草业科学与技术学院，草业科学北京市重点实验室，北京100193）摘要：种子使植物能够在恶劣的环境条件下生存，将遗传信息从亲代传递给下一代。种子活力是农业中的一个重要
性状，直接影响田间出苗率和作物产量。然而，由于种子老化，种子活力在贮藏过程中下降。为了有效地保护基因
资源，减少由于种子老化给农业生产带来的巨大经济损失，有必要探究种子老化的机制，以便了解种子老化的起因
以及老化过程中发生的一系列重要事件。在种子贮藏过程中，高温高湿是加速种子老化的两个主要因素。活性氧
（ROS ）引起的氧化损伤是主要原因。ROS 可导致蛋白质损伤、脂质过氧化、染体端粒结构异常和DNA 损伤引起
的各种细胞成分损伤。此外，ROS 还诱导细胞程序性死亡，导致种子老化。种子在吸胀初期会对一些损伤进行修
复，但是，如果对关键结构造成巨大损伤，就会导致修复失败，种子永久失去活力，无法在相对较短的时间内正常发
芽。种子老化的确切机制尚未得到全面研究。基于此，本研究主要综述了种子老化过程中ROS 的产生以及清除途
径、ROS 对生物大分子的影响、染体端粒系统对种子老化的响应以及种子耐老化相关基因的研究进展，并提出了
展望。这对了解种子老化的原因以及种子老化机制的解析具有重要意义。
关键词：种子老化；活性氧；氧化胁迫；染体端粒；蛋白质羰基化；细胞程序性死亡
Studies on the regulation of seed aging by reactive oxygen species and telomeres SUN Shou -jiang ， MAO Pei -sheng *
， DOU Li -ru ， JIA Zhi -cheng ， SUN Ming ， MA Wen ， OU Cheng -ming ， WANG Juan
College of Grassland Science and Technology ， China Agricultural University ， Key Laboratory of Pratacultural Science ， Beijing 100193， China Abstract ： Seeds enable plants to survive in harsh environmental conditions and can transmit genetic information from their parents to the next generation. Seed vigor is an important character in agriculture ， which directly affects the field emergence rate and crop yield. However ， due to seed aging ， seed vigor decreased during storage. In order to effectively protect genetic resources and reduce the huge economic losses caused by seed aging to agricultural production ， it is necessary to explore the mechanism of seed aging in order to understand the causes of seed aging and a series of important events that occur in the aging process. During seed storage ， high temperature and humidity are the two main factors to accelerate seed aging. The oxidative damage caused by reactive oxygen species （ROS ） is the main reason.
ROS can interact with any biological macromolecule ， leading to protein damage ， lipid peroxidation ， chromosomal telomere structure abnormality and various cell components damage caused by DNA damage. In addition ， ROS may also induce programmed cell death ， leading to seed aging. At the initial stage of imbibition ， the
DOI ：10.11686/cyxb2022417http ：//cyxb.magtech 收稿日期：2022-10-18；改回日期：2023-01-10
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31971754）资助。
作者简介：孙守江（1990-），男，甘肃景泰人，在读博士。E -mail ： 931620185@qq
∗ 通信作者 Corresponding author. E -mail ： maops@cau.edu
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seeds will repair some damage，but if they cause great damage to key structures，they will fail to repair，and the seeds will lose their vitality permanently，so they cannot germinate normally in a relatively short time.The exact mechanism of seed aging has not been fully studied.Based on this，this study mainly reviewed the generation and elimination of ROS during seed aging，the influence of
ROS on biological macromolecules，the response of chromosome telomere system to seed aging，and the research progress of genes related to seed aging，which is of great significance for understanding the causes of seed aging and analyzing the mechanism of seed aging.
Key words：seed aging；reactive oxygen species；oxidative stress；telomeres；protein carbonylation；programmed cell death
种子是农业中重要的生产资料，也是众多商业化作物的基本繁殖方法。此外，在种子库中，种子可以长期保存遗传物质多样性［1］。另一方面，在全球气候变暖，生态系统发生变化后，种子在生态系统以及环境恢复工作中也发挥着非常重要的作用。然而，种子即使在最佳条件下储存，也不可避免发生老化，随着贮藏时间的延长，所有种子最终都会失去活力，这一过程称为种子老化［2］。据估计，全球每年约有25%的种子失去活力，导致巨额的经济损失，严重影响农业的健康发展。
有关种子老化的原因目前尚不完全明确，最早由Harman［3］提出并被广泛认同的自由基学说认为，生物体内产生的活性氧（reactive oxygen species， ROS）与生物体内的核酸、蛋白质、脂质等生物大分子进行反应是引起种子老化的主要原因。生物体发生氧化还原反应时，O2与线粒体电子传递链（mitochondrial electron transport chain， mETC）渗漏的电子结合生成具有高反应活性的离子、分子或自由基被称为ROS。研究表明，ROS在生物体内的具体作用取决于其在作用部位的浓度。低浓度时，
ROS可以作为第二信使在细胞信号转导途径中介导多种应答反应［4］。生物体内的ROS在一般情况下处于动态平衡，当生物体受到外界胁迫时，细胞自我调节平衡被扰乱，生物体内产生大量ROS且清除能力减弱，从而导致ROS在细胞中积累，最终对生物大分子造成氧化损伤甚至导致细胞死亡。
线粒体是重要的细胞器，其主要作用是在细胞呼吸过程中产生腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），是细胞的能源动力“工厂”。同时在种子老化过程中，线粒体也是产生ROS的主要位点［5］。研究发现，种子老化影响线粒体的呼吸模式，新鲜成熟的种子从开始发生老化到活力完全丧失会表现出复杂多变的呼吸模式，包括细胞素途径（cytochrome oxidase，COX）、交替氧化途径（alternative oxidase，AOX）和解偶联蛋白（uncoupling protein， UCP）途径等［6］。线粒体在产生能量时会将电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧质子及其他离子浓度的不对称分布就会形成线粒体膜电位。线粒体膜电位是维持线粒体内氧化磷酸化，产生ATP的先决条件。而ROS可以使线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore， MPTP）开放，进而导致线粒体膜电位降低，随后释放细胞素C和细胞死亡诱导因子，最终诱导细胞程序性死亡，导致种子活力丧失［7］。
不同学者从不同角度对种子老化进行研究，极大地促进了对种子老化的理解。研究表明，在种子老化过程中，一些生物大分子变化以及种子细胞生理生化变化与种子的老化具有因果关系，例如脂质过氧化［8］、蛋白质羰基化［9］、Amadori Maillard反应［10］和程序性细胞死亡［11］。然而，种子老化代表着一种复杂的生物学特征，其与多种生化、分子、代谢和生理过程有关［12］。因此，种子老化的
确切机制尚未得到全面研究。基于此，本研究主要综述了种子老化过程中ROS的产生以及清除途径、ROS在种子老化过程中的作用、ROS对生物大分子的影响、染体端粒系统对种子老化的响应以及种子耐老化相关基因的研究进展，这对了解种子老化的原因以及种子老化机制的解析具有重要的意义，为未来种子老化相关研究需求提供了建议。
1　活性氧在种子老化中的作用
1.1　ROS的产生及清除途径
ROS是有氧呼吸的副产品之一［13］。种子内低浓度的活性氧是缓解休眠、种子萌发和抵御病原体的重要信号
Vol.32，No.8ACTA PRATACULTURAE SINICA （2023）分子［14］。然而，种子长期贮藏在不良条件下就会导致ROS 在细胞中积累［15］。ROS 含量的增加通常被认为是影响种子老化的最重要因素，ROS 会对脂质、蛋白质和DNA 造成氧化损伤，最终导致活性丧失［16］。线粒体呼吸电子传递链（ETC ），特别是复合物I 和Ⅲ，是活性氧的主要来源（图1）。在正常情况下，ROS 的产生与清除处于动态平衡状态，种子发生老化时，抗氧化系统发挥着清除ROS ，减少氧化损伤的功能，过量的ROS 也会攻击线粒体内生物大分子，导致蛋白无法正常表达、膜系统解体和抗氧化酶失活等，使得抗氧化系统失去原有的功能。线粒体中有多种预防ROS 过量产生以及清除过量ROS 的机制。植物线粒体mETC
有多条途径存在，其中包括COX 主路途径、AOX 途径和UCP 途径。后两者与COX 主路途径中的复合体I 、复合体Ⅲ和复合体Ⅳ不同，不产生质子电化学势能［17］。交替氧化酶介导的交替呼吸途径对不敏感，可氧化泛醌，还原氧。而解偶联蛋白介导的解偶联呼吸途径，可破坏H +电化学梯度［18］。AOX 与UCP 共同构成了抵御氧化损伤的防御体系。其中，交替氧化途径可以起到电子分流的作用。对AOX 的电子流量进行生化控制，可以减少mETC 产生ROS ［19］。AOX 分流电子的能力具有组织和发育的特异性［20］，
部分种子中
图1　种子老化过程中活性氧的产生和清除
Fig. 1　Production and elimination of reactive oxygen species during seed aging
CXI 、CXII 、CXIII 、CXIV 、 CXV 、VDAC 、CAT 、GPX 、APX 、NADH 、NAD +、FADH 2、FADH 、ADP 、ATP 、GSH 、GSSG 、MDHAR 、DHAR 、AsA 、DHA 、NADP +和NADPH 分别表示NADH-Q 还原酶、琥珀酸-Q 还原酶、细胞素C 还原酶、细胞素C 氧化酶、ATP 合成酶、电压依赖性阴离子通道、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型黄素二核苷酸、氧化型黄素二核苷酸、腺嘌呤核苷二磷酸、腺嘌呤核苷三磷酸、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶、抗坏血酸、氧化型抗坏血酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。下同。CXI ， CXII ， CXIII ， CXIV ， CXV ， VDAC ， CAT ， GPX ， APX ， NADH ， NAD +， FADH 2， FADH ， ADP ， ATP ， GSH ， GSSG ， MDHAR ， DHAR ， AsA ， DHA ， NADP + and NADPH represent NADH-Q reductase ， succinic acid-Q reductase ， cytochrome C reductase ， cytochrome C oxidase ， ATP synthetase ， voltage -dependent anion channel ， catalase ， glutathione peroxidase ， ascorbate peroxidase ， reduced nicotinamide adenine dinucleotide ， oxidi
reactive to
zed nicotinamide adenine dinucleotide ， reduced flavin dinucleotide ， oxidized flavin dinucleotide ， adenosine diphosphate ， adenosine triphosphate ， reduced glutathione ， oxidized glutathione ， monodehydroascorbic reductase ， dehydroascorbic reductase ， ascorbic acid ， oxidized ascorbic acid ， niacinamide adenine dinucleotide phosphate and reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. The same below.204
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AOX途径发生在种子吸胀早期，直至mETC被完全激活可高效地产生ATP［21］。机体代谢发生紊乱时，AOX分流电子的能力通常会增加以预防ROS的过量积累［22］，同时，逆境胁迫下多种植物中的AOX1a基因的表达量都会升高［23］。UCP则是线粒体载体蛋白质家族的成员，能使H+从线粒体内膜渗透到线粒体内，从而消除mETC中的电位差，导致氧化磷酸化途径受损。UCP可以被ROS激活，与AOX一样，通过减少ROS的产生来降低细胞所受到的氧化损伤［24］。与AOX和UCP类似，糖及其相关的代谢产物也在线粒体水平上参与了预防ROS过量产生的过程。可溶性糖主要通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成途径间接参与ROS的产生和清除［25］。植物己糖激酶（hexokinase， HXKs）是所有生物中普遍存在的蛋白质，催化葡萄糖和果糖的磷酸化，是一种真正的葡萄糖传感器［26］。马铃薯（Solanum tuberosum）mtHXK可以促进二磷酸腺苷（adenosine diphosphate， ADP）的稳态循环，调控线粒体mETC产生H2O2［27］。
如图1所示，线粒体中存在着一系列的抗氧化酶以及抗氧化物质，及时清除过量的ROS以维持细胞的正常代谢，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化氢酶（catalase， CAT）、抗坏血酸-谷胱甘肽循环（ascorbate-glutathione cycle， AsA-GSH）中的谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase， GR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase， MDHAR）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）以及抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（glutathione， GSH）。在线粒体抗氧化系统中，SOD首先将O2•-歧化生成H2O2和O2，CAT再将H2O2转变成无害的H2O和O2。SOD是种子细胞内重要的抗氧化酶，其主要功能是催化O2•-歧化生成H2O2和O2，从而避免形成活性更高的·OH。因此，SOD被认为是种子细胞清除ROS的第一道防线［28］。种子生理代谢正常时，SOD活性与O2•-的含量成正比，随着胁迫加重，O2•-的衍生物（·OH、H2O2等）反而会抑制SOD活性。CAT在清除H2O2时具有重要作用，其可以直接催化H2O2生成H2O和O2，该反应也是种子清除ROS的重要途径之一。O2•-和H2O2可以同时或分别与CAT反应形成复合物，使CAT钝化从而抑制其活力［29］。AsA-GSH循环是线粒体内另一条重要的H2O2清除途径，该途径包括APX、GR、DHAR和MDHAR四种酶，以及GSH/GSSG、NADPH/NADP和AsA/ DHA 3对氧化还原对。其中GSH、AsA、DHAR和GR位于线粒体基质，MDHAR和APX则位于线粒体膜［30］。APX与AsA催化H2O2还原成H2O，同时AsA转化为DHA；DHAR和MDHAR催化DHA还原成AsA，同时GSH 被氧化成氧化型谷胱甘肽（glutathione， GSSG）；最后GR将GSSG再生成GSH。其中，APX和GR是As
A-GSH循环顺利进行的关键酶。此外，之前所提到的HXK所衍生的葡萄糖-6-磷酸盐可以为Smirnoff-Wheeler途径中的L-半乳糖提供营养，促进AsA的生物合成，最终有助于清除H2O2。种子内ROS的产生和聚集会导致DNA 的氧化损伤，最终影响种子寿命［31］。
1.2　脂质过氧化
种子老化过程中逐渐积累的ROS会攻击细胞膜磷脂中的多不饱和脂肪酸，导致长链脂肪酸不断分解为较小的化合物，引起细胞脂质过氧化，导致细胞通透性丧失。脂肪酸的分解加剧了细胞膜的流动性及通透性，最终影响细胞膜的正常功能代谢［32］。脂质过氧化是一种自氧化过程，一旦开始，反应就会自我传播和自我加速。脂质过氧化的最终产物是各种相对稳定的脂溶性化合物，如醛类、酮类、烷烃、羧酸和聚合产物［33］。这些产品可以从产生地扩散，然后很容易穿透生物膜［17］。此外，这些产物通常具有很强的反应性，并影响细胞的其他成分和细胞外基质［7］。·OH是脂质过氧化最有效的诱导剂［34］，其会攻击膜脂中的不饱和脂肪酸，最终分解为丙二醛（malondialdehyde，MDA）等。MDA可介导蛋白质氧化，导致蛋白质修饰、聚集和构象变化，并最终导致蛋白质功能的改变。研究发现，大豆（Glycine max）种子在99%相对湿度（relative humidity， RH），42 ℃加速老化不同时间后，MDA含量比对照组增加了64.23%；表明脂质过氧化引起了细胞膜损伤。脂氧合酶（lipoxygenase， LOX）是脂质代谢中的一个关键酶，能将膜中的磷脂成分作为底物催化脂质过氧化［2］。在水稻（Oryza sativa）种子中研究发现，将3个LOX相关基因过表达会加速膜完整性的破坏，而LOX相关基因的表达减
少会导致种子贮藏期间种子活力的增加［17］。LOX调控种子活力的分子机制还有待进一步深入研究。
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Vol.32，No.8
ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）
1.3　蛋白质羰基化
蛋白质羰基化（protein carbonylation）是蛋白质的非酶促不可逆羰基修饰过程。在种子老化过程中，ROS 的大量产生会攻击赖氨酸、脯氨酸和苏氨酸等残基或者直接作用于肽键，形成羰基化蛋白［35］。目前，在家榆（Ulmus pumila）老化种子的线粒体中观察到了蛋白质羰基化现象［16］。线粒体蛋白的总羰基化水平在不同细胞器之间存在显著差异，其中线粒体的羰基化水平最高。通过质谱对家榆种子的蛋白进行鉴定，发现种子老化过程中的羰基化修饰主要发生在参与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle， TCA cycle）、ATP 合成、线粒体加工和细胞转运蛋白中。羰基化修饰会造成这些蛋白功能丧失并加速分解，导致种子活力的丧失［16］。有研究表明可将蛋白羰基化作为种子老化的标志。对豇豆（Vigna unguiculata）种子进行不同次数和不同天数的水引发后进行自然贮藏老化，发现老化处理4年种子较未处理种子的氧化产物特别是羰基化蛋白质的积累增多，可能是老化种子寿命降低的原因［36
］。在氧化应激过程中，脂质过氧化产物、羰基形成和氨酸残基的结合降低了线粒体蛋白的活性。研究发现，榆树种子中有48个线粒体蛋白在衰老过程中发生变化，这些变化与三羧酸循环（TCA）和线粒体ETC［16］有关。Mao等［37］也发现燕麦（Avena sativa）种子老化过程中TCA循环中的蛋白质下调，与线粒体mETC相关的几种酶上调。桥粒芯糖蛋白（desmoglein 1，DSG1）的缺失导致线粒体形态变大，嵴数量减少，脂质组成改变，蛋白质减少，呼吸能力降低［38］。因此，各种脂质和蛋白质有助于形成和支持植物线粒体嵴，从而改善线粒体的功能。1.4　遗传物质损伤及修复
在种子老化过程中，染体畸形导致细胞有丝分裂延迟，影响细胞的伸长以及种子的萌发［25］。同时DNA的合成能力与种子劣变程度也有密切的关系，高活力种子DNA的合成能力高［25］。老化导致种子中DNA复制延迟，而水合处理能减少 DNA 复制延迟的时间［39］。水稻种子吸水萌发过程中，未老化种子DNA和RNA均保持较高的完整性；但老化后受损的DNA在种子萌发过程中进行了修复，DNA 恢复完整性，但同时出现DNA片段化，核小体降解，RNA 完整性并没有得到修复；老化后发芽率为44%的种子，在吸水过程中DNA和RNA的完整性均未修复，在死种子中，整个吸水过程中均检测到DNA降解为碎片［40］。种子在贮藏过程中伴随着核酸降解和核酸完整性的丧失［41］。大豆种子长时间贮藏导致种子寿命降低，最终导致种子发芽能力丧失，种子DNA和RNA的完整性降低［41］。与DNA相比，RNA由于其单链结构而更容易受到环境的氧化破坏［42］。最终，RNA结构的破坏影响基因的转录和翻译，低活力种子表现出蛋白质组的改变［43］。DNA双链断裂（double-strand breakage， DSB）被认为是
最危险的核酸损伤类型，会导致大面积染体区域丢失，并限制种子发芽［26］。这种类型的损害需要一系列修复系统的运行来保证正常的发芽和幼苗的形成。DNA连接酶在实现DSB修复和维持种子活力方面起着关键作用［43-45］。AtLIGs在修复DSB中的重要功能已被充分证明［42］。如预期的那样，连接酶功能丧失突变株lig4-5，lig6-1和双重突变株lig4-5和 lig6-1的种子寿命降低［45］。 DNA损伤检查点激酶ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED（ATM）和ATM AND RAD3-RELATED（ATR）被DSB激活，并在种子寿命中发挥积极的调节作用［28］。ATM延迟了老化种子的萌发，其是由细胞周期抑制剂SIAMESE-RELATED 5介导，与此相符的是，ATM功能丧失突变体表现出延长种子寿命表型。ROS是导致DNA单链断裂的主要原因。通过破坏或修饰脱氧核糖单位，使支架断裂，缩短种子寿命，其中最常见的修饰之一是7，8-二氢-8-氧鸟嘌呤（8-oxo-G）。涉及鸟嘌呤C-8位置的羟基化［45］。可以通过碱基切除修复（base-excision repair， BER）途径去除8-oxo-G，AtOGG1也参与了8-oxo-G的去除，最终提高了种子的寿命，AtOGG1的过表达降低了8-oxo-G的水平并大大提高了种子对老化的耐受性［44］。
种子中存在强大的损伤修复系统，使其能够对生物分子和细胞结构的破坏降至最低。目前，已有研究证实，种子老化前期受损的DNA可以被修复。DNA双键断裂修复（double-strand breakage repair）主要以同源重组（homologous recombination）和非同源末端连接（non-homologoous end joining）两种方式修复［29］（图2）。例如，黑麦（Secale cereale）种子充分吸水后可以修复γ射线造成的DNA损伤［44］。功能性DNA修复及其复合物的维持是保持种子活力的必要条件［18］。如核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）会通过识别损伤的DNA结构来切除

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