国际麻醉学与复苏杂志2021年3月第42卷第3期Ini J Anesth Resus,March2021,Vol.42,No.3239
-论著G1通过核因子E2相关因子2减轻神经元氧糖剥夺
损伤
高子军「夏莹2王世全3
|西安交通大学附属红会医院麻醉科710054；2空军军医大学西京医院消化急诊科，西安710032；'空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科，西安710032
通信作者：王世全,Email:wangshiquan-301@163
【摘要】目的探讨G1对原代神经元氧糖剥夺损伤后氧化应激指标的影响及核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-re-lated factor2,Nrf2)在其中的作用。方法将培养7d的C57BL/6胎鼠皮质原代神经元细胞按随机数字表法分为6组(每组6孔)：对照组(C组)、氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)组、溶剂组、G1组、G1+对照病毒组和G1+ Nrf2慢病毒组。C组，不做任何处理；OGD/R组,OGD2h后恢复氧糖；溶剂组,OGD2h后在培养液中加入适量溶剂，继续培养22h;Gl组，行OGD/R模型，复氧复糖后的正常培养液中加入终浓度为5p_mol/L的G1，继续培养22h;Gl+对照病毒组，感染对照慢病毒的原代神经元细胞行OGD/R模型，其余处理同G1组；G1+Nrf2慢
病毒组，感染了Nrf2shRNA慢病毒的原代神经元细胞行0GD/R模型，其余处理同G1组。利用分光光度法检测乳酸脱氢S6(lactate dehydrogenase,LDH)含量，应用细胞计数试剂盒(cell counting kit-&CCK-8)法检测细胞活力，采用ELISA法检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malonalde-hyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide,SOD)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的含量，采用Western blot和免疫荧光法检测Nrf2的表达。结果与C组比较.OGD/R组和溶剂组LDH.MDA和ROS含量升高，细胞活力.SOD和T-AOC 含量降低,Nrf2总蛋白水平和核内蛋白水平均升高(P<0.05)；与OGD/R组比较,G1组LDH.MDA和ROS含量降低，细胞活力、SOD和T-AOC含量升高，Nrf2总蛋白水平和核内蛋白水平升高(P<0.05)。与G1组及G1+对照病毒组比较,G1+Nrf2慢病毒组细胞活力、SOD和T-AOC含量降低，LDH、ROS及MDA含量升高(P<0.05);G1组与G1+对照病毒组比较，各指标差异均无统计学意义(P>0.05)o结论G1可以通过Nrf2通路增加抗氧化酶活性减轻原代神经元OGD/R损伤。
【关键词】G1；核因子E2相关因子2；神经元；氧糖剥夺/复氧
基金项目：陕西省自然科学基础研究计划一般项@(2019JQ-979,2020JM-330)：西安市I类项目(201901005)
D01:10.3760/cma.j321761-20200919-00230
G1attenuates neuronal injury induced by oxygen glucose deprivation through nuclear factor-E2-related
factor2
Gao Zijun1,Xia Ying2,Wang Shiquan3
'Department of Anesthesiology,Honghui Affiliated Hospital of Xi'an Jiao Tong University,Xi'an710054,China;department of Digestive Emergency,Xijing Hospital,Air Force Medical University,Xi'an710032,China;'Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine,Xijing Hospital,Air Force Medical University,Xi r an710032,China
Corresponding author:Wang Shiquan,Email:************************
[Abstract]Objective To explore the effects ofGl on oxidative stress index in primary cortical neurons after oxygen glucose deprivation and the role of nuclear factor related factor2(Nrf2)during the process.Methods Primary cortical neurons from C57BL76embryonic mice were cultured for seven days and divided into six groups according to the random number table method(n=6):a control(C)group, an oxygen glucose deprivation/reoxygenation(OGD/R)group,a solvent group,a G1group,a G1+control virus group and a G1+Nrf2lentiviral group.The C group did not receive any treatment,while the OGD/R group was deprived of o xygen and glucose for2h before recovery.The solvent group was added with a proper amount of s olvent2h after OGD followed by cultivation over22h.F
or the G1group,OGD/R modeled neurons were used,and G1was added into normal medium to reach a final concentration of5jimol/L to treat over22h.Primary neurons in the G1+control virus group were infected with control lentivirus to establish the model of OGD/R,before receiving the same treatment as the G1 group.Primary neurons in the Gl+Nrf2lentivirus group were infected with Nrf2shRNA lentivirus to establish the model of OGD/R,before receiving the same treatment as the G1group.The release of lactate dehydrogenase(LDH)was detected by spectrophotometry,and the cell survival was measured by cell counting kit-8(CCK-8)assay.Then,the contents of reactive oxygen species(ROS),malonaldehyde(MDA),su
peroxide(SOD)and total antioxidant capacity(T-AOC)were quantified by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The levels of Nrf2 were examined by Western blot and immunofluorescence.Results Compared with the C group,both the OGD/R group and the solvent group presented remarkable increases in LDH,MOA and ROS contents,decreases in cell survival,SOD and T-AOC contents,and increases in total Nrf2and nuclear protein levels(P<0.05).Compared with the OGD/R group,the G1group presented remarkable decreases in LDH, ROS and MDA contents,increases in cell survival,SOD and T-AOC contents,and increases in total Nrf2and nuclear protein levels(P< 0.05).Compared with the G1group and the Gl+control virus group,the Gl+Nrf2lentivirus virus group pro
duced decreases in cell survival, SOD and T-AOC contents,and increases in LDH,ROS and MDA contents(P<0.05).There were no statistical differences in each indicator between the G1group and the G1+contrl virus group(P〉0.05).Conclusions G1can alleviate OGD/R injury in primary neurons through increasing the activity of a ntioxidant enzymes via the Nrf2pathway.
[Key words]Gl;Nuclear factor-E2-related factor2;Neuron;Oxygen glucose deprivation/reoxygenation
Fund program:General Project of Shaanxi Natural Science Basic Research Program(2019JQ-979,2020JM-330);The Class I Program of Xi'an(201901005)
DOI:10.3760/cma.j321761-20200919-00230
G蛋白耦联受体KGPR30）是雌激素的膜受体，GPR30作用模式与传统雌激素受体有所不同，除了参与转录调控外，还介导雌激素的快速非基因反应叭激活GPR30能够对多种神经损伤模型发挥保护作用叫但具体机制有待进一步探索。缺血/再灌注损伤早期核因子E2相关因子2（nuclear fac-tor-E2-related factor2,Nrf2）调节的抗氧化机制在神经保护中扮演者重要的作用叫GPR30特异性激动剂G1是否具有抗氧化作用，以及G1的抗氧化作用是否通过Nrf2通路发挥作用有待进一步探讨。本研究拟评价G1对氧糖剥夺復氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）损伤后原代神经兀细胞氧化应激指标的影响以及Nrf2通路在其中的作用。
1材料与方法
1.1研究对象与分组
采用随机数字表法将原代培养的皮质神经元细胞分为6组（每组6孔）：C组、OGD/R组、溶剂组、G1组、G1+对照病毒组和Gl+Nrf2慢病毒组。C组，不做任何处理；OGD/R组,OGD2h后恢复氧糖；溶剂组,OGD2h后在培养液中加入适量溶剂，继续培养22h；Gl组，行OGD/R模型，复氧复糖后的正常培养液中加入终浓度为5jimol/L的G1，继续培养22h; G1+对照病毒组，感染对照慢病毒的原代神经元细胞行0GD/R模型，其余处理同G1组;G1+Nrf2慢病毒组，感染了Nrf2shRNA慢病毒的原代神经元细胞行OGD/R模型，其余处理同G1组。
1.2皮质神经元细胞原代培养
显微操作取孕18d的C57BL/6胎鼠脑组织，剔除脑膜和微血管，小心分离皮质，剪碎,0.25%胰酶消化15min，用含10%胎牛血清的达尔伯克必须基本培养液中和，1000r/minXlO min离心，弃上清，用含2% B27的Neurobasal培养液悬浮细胞，以2500个/mn?接种于经多聚赖氨酸包被的培养板中。之后每3d 半量换液，继续37r.5%CO2+95%O2条件下培养。1.3神经元OGD/R模型的建立
取培养至7d的原代皮质神经元细胞.使用无糖改良的达尔伯克基本培养液（生产批号：2005529,Gibco公
司，美国）培养液替代正常细胞培养液，并将其置于37r.5%CO2+95%N2的混合气体培养箱，氧糖剥夺2h后换成正常细胞培养液，然后置于37T、5%CO2的细胞培养箱中继续培养22h。1.4慢病毒转染
原代神经元以2500个/mm?密度接种于6孔板海孔加培养液3ml，生长至4d。根据上海吉凯生物公司的慢病毒手册，在1ml Neurobasal中加入6g/L聚凝胺1|J，在含有聚凝胺的培养液中加入对照慢病毒（生产批号:GIDV0210630，上海吉凯生物化学有限公司）或Nrf2shRNA慢病毒（生产批号:GIDV0210631，上海吉凯生物化学有限公司），目标序列为5--CGCTGAG-TACTTCGAAATGTC-3',1板加对照慢病毒，1板加Nrf2shRNA慢病毒。转染12h后更换为正常培养液，72h后通过倒置荧光显微镜观察细胞绿荧光蛋白的表达，并分析病毒转染效率，然后进行OGD/R实验。1.5ELISA法检测活性氧（reactive oxygen species,
ROS）、丙二醛（malonaldehyde,MDA）、超氧化
物歧化酶（superoxide,SOD）和总抗氧化能力
（total antioxidant capacity,T-AOC）水平
严格按照SOD试剂盒（生产批号:BAE09037，南京建成科技有限公司）、T-AOC试剂盒（生产批号：JK-EA02431，上海晶抗生物科技有限公司）、MDA 试剂
盒（生产批号:NXF-4049，南京建成科技有限公司）和 ROS 试剂盒（生产批号:SOO33，碧云天生物技
术有限公
司）说明书进行。
1.6 Western blot 法检测 Nrf2 表达
按照蛋白提取试剂盒说明，提取各组蛋白，蛋
白定量试剂盒（生产批号:CW0014S ，北京康为世纪
生物科技有限公司）测定蛋白浓度。取20憾蛋白
进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法将电泳产物转移
到PVDF 膜。5%脱脂奶粉常温封闭1 h，分别加入 一抗 Nrf2（l ：l 000，生产批号:62352, Abeam 公司，英
国）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos-
phate dehydrogenase, GAPDH ） （1 ： 1 000，生产批号: 181602, Abeam 公司，英国）、组蛋白（1 ： 1 000，生产批
号：1791,Abeam 公司，英国）,4乜孵育过夜；辣根过氧 化物酶标记的二抗（1:10 000，生产批号:Ex020，西安
壮志生物科技有限公司）室温孵育2 h,TBST 洗膜3次, 滴加发光液（生产批号:wbklso500,Milipore 公司，美国）
后在凝胶成像仪采集图像。以目的蛋白与内参的比值 表示目的蛋白的相对表达量。
1.7免疫荧光检测Nrf2表达
将培养的原代神经元细胞爬片4%多聚甲醛固定
5 min，然后用PBS 冲洗3遍，每遍5 min，加入一抗 MAP-2（l ：300，生产批号:5392,Abeam 公司，英国）和
Nrf-2（1:200，生产批号:62352, Abeam 公司，英国）, 4乜过夜，接着用PBS 冲洗3遍，每遍5 min，加入抗兔
荧光二抗（1:500，生产批号：150064, Abeam 公司，英 国）和抗鸡荧光二抗（1 ：500住产批号：150173,Abeam
公司，英国），用防淬灭封片机封片。然后用荧光显微
镜观察，统计分析。
1.8 LDH 释放率的测定
神经元细胞以2 500个/mn?的密度接种于96孔
板，每孔加培养液100 口，生长至7 d 。每组随机取6 孔细胞，用分光光度法测定培养液LDH 活性。每孔吸 取50皿培养液加入50皿测定试剂（生产批号：
SLBT 1705,Sigma 公司，美国），37七孵育30 min ，用酶
标仪490 nm 测定光密度（D ）值。
1.9 CCK-8检测细胞存活率
神经元细胞以2 500个/mm ，的密度接种于96孔板,
每孔加培养液100 口，生长至7 d 。各组均加入含10%
CCK-8溶液的Neurobasal 培养液,37七孵育2h 。每个浓
度设置6个复孔，酶标仪450 nm 处测定其D 值。
1.10统计学分析
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，正态
分布的计量资料以均数土标准差（牡s ）表示，组间比
较采用单因素方差分析，两两比较采用Krus-
kal-Walliso P<0.05为差异有统计学意义。2结果
2.1 G1对皮质神经元0GD/R 损伤后LDH 、MDA 、
ROS 、SOD .T-AOC 含量及细胞活力的影响
与C 组比较,OGD/R 组和溶剂组LDH 、M DA 和ROS 含量升高，细胞活力、SOD 和T-AOC 含量降低（P<0.05）； 与0 G D/R 组比较,G 1组LDH.MDA 和ROS 含量降低，细
胞活力、SOD 和T-AOC 含量升高（P<0.05）。见图1。
a
0000000004 3 2 1
(&)<；於迩
HCFI
a
(M O U I E )«^v a w
0000004 3 2
C 组OGD/R 组溶剂组G1组炉
组别
0 C 组OGD/R 组溶剂组G1组
组别 ®
C 组OGD/R 组溶剂组G1组
组别
5()
2
()()2(hD w e w 机
U O S
50
reactive oxygen species是什么意思50
C 组OGD/R 组溶剂组G1组⑥
组别.5.0.5.0Z 21
.1.5
O
0.P U V B
扫
如O O V
H
C 组OGD/R 组溶剂组G1组
组别
8 6 4 2 0
O
注：与C 组比较//><0.05；与OGD/R 组比较,b P<0.05;C 组：对照组；OGD/R 组：氧糖剥夺復氧组:LDH ：乳酸脱氢酶；MDA ：丙二醛；ROS ：活 性氧;SOD ：超氧化物歧化酶:T-AOC ：总抗氧化能力；OGD/R ：氧糖剥夺/复氧
图1 G1对皮质神经元OGD/R 损伤后LDH 、MDA 、ROS 、SOD 、T-AOC 含量及细胞活力的影响A ：LDH 释放率；B ：MDA 含量:C ：ROS 含量；D ：细 胞活力:E ：SOD 含量；F ：T-AOC
含量
2.2 G1对皮质神经元OGD/R 损伤后Nrf2总蛋白水
平和核内蛋白水平的影响
与C 组比较.OGD/R 组和溶剂组Nrf2总蛋白水平 和核内蛋白水平均升髙(P<0.05)；与0 G D/R 组比较,
G1组Nrf2总蛋白水平和核内蛋白水平升高(P<0.05)o
见图2。
2.3 shRAN 下调Nrf2对G1神经保护的作用
与G1组及G1+对照病毒组比较,G1+Nrf2慢病
毒组细胞活力、SOD 和T-AOC 含量降低，LDH 、ROS
及MDA 含量升高(P<0.05);Gl 组与G1+对照病毒
组各指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)o 见图3。
Nrf2
OGD/R 组溶剂组G1组C 组OGD/R 组溶剂组G1组
Nrf2—• —* —
—
Merge
MAP-2
C 组OGD/R 组溶剂组G1组 “ 组别
u u o .i H 、£N
C 组OGD/R 组溶剂组G1组
组别
C 组
©
Hddvo 电
N
77
=
©
b
注：与C 组比较，叨<0.05；与OGD/R 组比较,'P<0.05；C 组：对照组;OGD/R 组：氧糖剥夺復氧组;OGD/R ：氧糖剥夺復氧；Nrf2：核因子E2相
关因子2；GAPDH ：甘油醛-3-磷酸脱氢酶;MAP-2：微管结合蛋口 2；Merge ：合并
图2 G1对皮质神经元OGD/R 损伤后Nrf2总蛋白水平和核内蛋白水平的影响A ：免疫荧光结果;B ：Nrf2总蛋A Western blot 结果;C ：Nrf2核蛋 白Western blot 结果;D ：Nrf2总蛋白相对表达量;E ：Nrf2核蛋白相对表达量
4o o o
o o o 3 2 1 (&)»®®H (n 组别
组别
200
(&)-R 史悬舄
G ］组 G1+对照病毒组G1+NK2慢病毒组
组别 ©
150 (g
u v e
M 如
d o s
00
50组别
©
(
営、二)嘲妣
30
V 」
2.0
(；】组 C1+对照病毒组G1+NK2慢病毒组
o o o o 8 6 4 2o
O
注：与G1组及G1+对照病毒组比较「P<0.05；Nrf2：核因子E2相关因子2；LDH ：乳酸脱氢酶；MDA ：丙二醛；ROS ：活性氧;SOD ：超氧化物歧
化酶;T-AOC ：总抗氧化能力；OGD/R ：氧糖剥夺/复氧
图3 3组皮质神经元细胞SOD ,T-AOC J.DH . ROS . MDA 含量及细胞活力比较A ：细胞活力；B ：SOD 含量；C ： T-AOC 含量;I)：LD H 释放率;E ：ROS 含量；F ：MDA
含量
3讨论
大量体内体外实验证实G1具有神经保护效应z，但具体机制还需进一步探索。缺血性卒中的发病机制非常复杂，涉及多种机制，氧化应激损伤在缺血性卒中急性期发挥着关键作用冋。发生氧化应激后过量生成的ROS可以破坏质膜、蛋白质和DNA，从而使得脂质过氧化产物MDA的含量增加叫发生脑缺血损伤后生成的过量ROS需通过体内的抗氧化酶进行清除。原代神经元OGD/R损伤后,ROS、MDA含量升高,SOD和T-AOC的有效活性降低叫有文献证实降低ROS、MDA含量，增加内源性抗氧化酶活性的举措可以发挥神经保护作用，那么G1的神经保护效应是否也通过抗氧化作用来实现？于是本实验测定T ROS、MDA、SOD和T-AOC的含量来评估G1对抗氧化作用的影响。本研究表明，与OGD/R组比较,G1组ROS和MDA含量降低,SOD和T-AOC含量升高，反映细胞损伤程度的LDH含量降低，提示G1可以通过增加内源性抗氧化能力降低神经元0GD/R损伤发挥神经保护效应。
G1可以通过激活GPR30上调第二信使环磷酸腺昔，环磷酸腺昔能激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA),PKA可以通过磷酸化相应转录因子而调控相应核转录因子的活性，从而发挥特定转录调控机制叫PKA 可以磷酸化环磷酸腺昔效应元件结合蛋白，磷酸化环磷酸腺昔效应元件结合蛋白可以作用于Nrf2促进Nrf2的核转位，从而促进下游基因表达叫大量研究表明,Nrf2信号通路是重要的内源性抗氧化应激通路
之一。在氧化应激条件下,Nrf2进入细胞核，在细胞核中与抗氧化反应元件结合，激活下游抗氧化基因，清除细胞过量产生的ROS，促进细胞氧化还原系统平衡，从而减轻细胞损伤。受抗氧化反应元件调控的抗氧化基因主要有SOD等叫已有研究表明，神经元OGD损伤后Nrf2的含量升高，上调Nrf2可以减轻原代神经元OGD/R损伤叫本研究结果表明，与C组比较,OGD/R组Nrf2蛋白水平升高；与OGD/R组比较,G1组Nrf2的含量进一步升高；提示G1可以上调OGD/R损伤后神经元Nrf2的表达量。利用慢病毒下调神飯N r f2结果显占G I组&G1+对照病毒组比较,Gl+Nrf2慢病毒组LDH、ROS和MDA含量升高，细胞活力、SOD和T-AOC含量降低。
综上所述,G1可以通过Nrf2通路增加抗氧化酶活性，减轻原代神经元OGD/R损伤。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献
[1]Feldman RD,Limbird LE.GPER(GPR30):A nongenomic recep
tor(GPCR)for steroid hormones with implications for cardiovascular disease and cancer[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2017,57: 567-584.DOI:10」146/annurev-pharmtox-010716-104651.
[2]Zhang Z,Qin P,Deng Y,et al.The novel estrogenic receptor
GPR30alleviates ischemic injury by inhibiting TLR4-mediated microglial inflammation[J/OL].J Neuroinflammation,2018.15(1): 206.DOI:10.1186/sl2974-018-1246-x.
[3]Yang T,Sun Y,Li Q,et al.Ischemic preconditioning provides
long-lasting neuroprotection against ischemic stroke:The role of Nrf2[J/0L].Exp Neurol,2020,325:113142.DOI:10.pneu rol.2019.113142.
[4]Pan MX,Tang JC,Liu R,et al.Effects of estrogen receptor
GPR30agonist G1on neuronal apoptosis and microglia polarization in traumatic brain injury rats[J].Chin J Traumatol,2018,21
(4)：224-228.D01:10.1016/j.cjtee.2018.04.003.
[5]Peng J,Zuo Y, al.Activation of GPR30with G1atten
uates neuronal apoptosis via src/EGFR/stat3signaling pathway after subarachnoid hemorrhage in male rats[J/OL].Exp Neurol, 2019,320：11300&001:10.pneurol.2019.11300&
[6]Nanetti L,Raffaeili F,Vignini A,et ai.Oxidative stress in isch
aemic stroke[J].Eur J Clin Invest,2011,41(12):1318-1322.DOI:
10.1111/j.1365-2362.
[7]孙剑，韩如泉.急性缺血性脑卒中患者的麻醉管理[J|.国际麻
醉学与复苏杂志,2018,39(5):473-478.DOI:10.3760/cma.j.iss n.1673-4378.2018.05.019.
[8]Schieber M,Chandel NS.ROS function in redox signaling and oxi
dative stress[J].Curr Biol,2014,24(10):R453-R462.DOL10.1016/ j.cub.2014.03.034.
[9]Zhang LL,Zhang ZJ.Sestrin2aggravates oxidative stress of neurons
by decreasing the expression of Nrf2[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci, 201&22(11):3493-3501.DOI:10.26355/eurrev_201806_15176.
[10]Khan K,Pal S, al.Prunetin signals via G-pro-
tein-coupled receptor.GPR30(GPER1):Stimulation of adenylyl
cyclase and cAMP-mediated activation of MAPK signaling in
duces Runx2expression in osteoblasts to promote bone regenera-
tionfj].J Nutr Biochem,2015,26(12):1491-1501.DOI:10.1016/
j.jnutbio.2015.07.021.
[11]Abdelaziz AI,Mantawy EM,Gad AM,et al.Activation of p CREB/Nrf-2
signaling mediates re-positioning of liraglutide as hepato-protective
for methotrexate-induced liver injury(MILI)[J/OL].Food Chem
Toxicol,2019,132:110719.DOLIO」016/j.fct.2019.110719. [12]Bellezza I.Giambanco I.Minelli A,et al.Nrf2-Keapl signaling in
oxidative and reductive stress[J].Biochim Biophys Acta Mol Cell
Res,2018.1865(5):721-733.DOI:10」016/j.bbamcr.2018.02.010.
[13]Yang J,Huang J,Shen C,el al.Resveratrol treatment in differ
ent time-attenuated neuronal apoptosis after oxygen and glucose
deprivation/reoxygenation via enhancing the activation of Nrf-2
signaling pathway in vitrojj].Cell Transplant,201&27(12):
1789-1797.DOI：10.1177/0963689718780930.
(本文编辑：张丽)
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。
发表评论