ATP 酶抑制因子1对脂多糖诱导的小鼠肺泡
巨噬细胞炎症反应及线粒体自噬的影响*
胡
琪1， 李瑞语2， 施昌盛1， 孙彩霞1， 方石磊1， 马
瑞1， 邵东华1△
（1江苏大学附属人民医院麻醉科，江苏 镇江 212002；2安徽医科大学附属安庆市第一人民医院骨科，
安徽 安庆 246052）
［摘
要］ 目的：本研究旨在探索ATP 酶抑制因子1（ATPase inhibitory factor 1， IF1）在脂多糖（lipopolysaccha‑
ride ， LPS ）诱导的肺泡巨噬细胞炎症模型中的作用。方法：用LPS 刺激小鼠肺泡巨噬细胞系MH -S 作为体外细胞炎症模型。利用CRISRP activation 质粒构建过表达IF1的MH -S 细胞系，采用Western blot 及RT‑qPCR 检测IF1的表达；ELISA 法检测细胞炎症因子白细胞介素6（interleukin -6， IL -6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor -α， TNF -α）
和IL -1β水平；JC -1和MitoSOX™ Red 分别检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential ， MMP ）和活性氧（reactive oxygen species ， ROS ）水平；Western blot 检测自噬相关蛋白LC3、线粒体膜蛋白TOM20和线粒体自噬蛋白parkin 水平；荧光共定位检测线粒体的标记探针MitoTracker Red 与自噬相关蛋白LC3的共定位情况。结果：LPS 刺激肺泡巨噬细胞后IF1表达水平降低，细胞炎症因子分泌增加（P <0.01），MMP 下降，ROS 水平升高、LC3-II/LC3-I 比值与parkin 蛋白水平升高，TOM20蛋白水平下降（P <0.01），Mito -Tracker Red 与LC3蛋白共定位增加。上调IF1后，过表达组中IF1表达水平升高，细胞炎症因子分泌也相应减少，MMP 和ROS 水平恢复，LC3-II/LC3-I 比值与parkin 蛋白水平下降，TOM20蛋白水平升高，MitoTracker Red 与LC3蛋白共定位减少。结论：IF1可能通过抑制肺泡巨噬细胞线粒体自噬并改善线粒体功能，从而减轻巨噬细胞炎症因子的分泌。
［关键词］ ATP 酶抑制因子1；肺泡巨噬细胞；炎症反应；线粒体功能；线粒体自噬［中图分类号］ R364.5； R363.2  ［文献标志码］    A
doi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.05.010
Effects of ATPase inhibitory factor 1 on lipopolysaccharide -induced mouse alveolar macrophage activation and mitophagy
HU Qi 1， LI Ruiyu 2， SHI Changsheng 1， SUN Caixia 1， FANG Shilei 1， MA Rui 1， SHAO
Donghua 1△
（1Department of Anesthesiology ， People's Hospital Affiliated to Jiangsu University ， Zhenjiang 212002， China ； 2Department of Orthopedics ， Anqing First People's Hospital of Anhui Medical University ， Anqing 246052， China. E -mail ： 138****1211@163 ）
［ABSTRACT ］ AIM ： To explore the role of ATPase inhibitory factor 1 （IF1） in lipopolysaccharide （LPS ）-in‑
duced alveolar macrophage activation and subsequent inflammatory response. METHODS ： Murine alveolar macrophages
（MH -S cells ） were stimulated by LPS in vitro . Overexpression of IF1 in MH -S cell line was established with the CRISPR activation system ， and the expression of IF1 was detected by Western blot and RT -qPCR. The levels of inflammatory fac‑
tors such as interleukin -6 （IL -6）， tumor necrosis factor -α （TNF -α） and IL -1β were detected by ELISA. Mitochondrial membrane potential （MMP ） and reactive oxygen species （ROS ） were detected by JC -1 and MitoSOX™ Red ， respectively.
The expression of autophagy protein LC3， mitochondrial protein TOM20， and mitophagy protein parkin was detected by Western blot. Immunofluorescence was used to detect the colocalization of mitochondrial marker probe MitoTracker Red
and autophagy protein LC3. RESULTS ： LPS decreased the expression of IF1， MMP ， and TOM20， while increased the release of inflammatory factors and ROS ， increased LC3-II/LC3-I ratio and parkin expression （P <0.01）， and enhanced the ［文章编号］ 1000-4718（2023）05-0846-09
［收稿日期］ 2023-02-06  ［修回日期］ 2023-04-05 * ［基金项目］ 镇江市第一人民医院科研项目（No. Y2020004-S ）；江苏省中医药科技发展计划（No. MS2021083）；镇江市科技计划项目（No. SH2022071）
△通讯作者 Tel ：138****1211； E -mail ：138****1211@163
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colocalization of Mito-Tracker Red and LC3 in alveolar macrophages. In the overexpression group， the expression of IF1 and TOM20 was upregulated，the level of MMP was upregulated， ROS and inflammatory factors were downregulated， the expression of parkin and LC3-II/LC3-I ratio were decreased， and the colocalization of Mito-Tracker Red with LC3 was re‑duced.CONCLUSION： IF1 may downregulate macrophage-derived inflammatory cytokines by inhibiting mitochondrial autophagy and improving mitochondrial function.
［KEY WORDS］ATP synthase inhibitory factor 1； alveolar macrophages； inflammatory response； mitochondrial function； mitophagy
在脓毒症发生发展过程中肺是最易受损的器官，被称为急性肺损伤（acute lung injury， ALI）［1］。巨噬细胞广泛分布于肺组织，肺内巨噬细胞的过度激活导致炎症因子失控性释放是脓毒症肺损伤的根本原因［2］。肺泡巨噬细胞线粒体受损同时分泌过量的细胞因子，加重细胞和组织的炎症损伤，从而加重
ALI［3］。目前ALI仍缺乏有效的，尽管临床采用机械通气可改善症状及其预后，其病死率仍很高［4-5］。因此，研究出减轻肺部炎症和组织损伤的方法至关重要。
临床上，大部分脓毒症患者都伴随着线粒体功能障碍［6］。有研究者猜测线粒体完整性在维持组织稳态和预防重度肺部疾病中尤为重要［7-8］。线粒体自噬通过选择性自噬的方法清除体内功能受损的线粒体，减少活性氧（reactive oxygen species， ROS）物质的积累，维持正常的线粒体质量，从而减轻炎症［2］。然而线粒体过度的自噬也是有害的，但目前尚未有报道研究其具体机制［9-10］。PINK1/parkin通路是线粒体自噬一条重要通路［11］。PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）是线粒体健康的分子传感器，当线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential， MMP）下降时，它检测线粒体功能的中断和信号，以招募和激活parkin，然后通过泛素化线粒体表面蛋白来扩增parkin。这些泛素化蛋白随后可被自噬受体识别，并通过与LC3蛋白直接相互作用将线粒体转化为自噬体进行降解，从而启动线粒体自噬［9］。TOM20是线粒体自噬标志物，当线粒体被自噬体消化后，位于线粒体膜上的TOM20也随之被降解［12］。
ATP酶抑制因子1（ATPase inhibitory factor 1，IF1）是线粒体中ATP酶抑制因子，在肿瘤和心血管疾病的研究中起到重要作用［13-15］。但目前对于IF1在急性肺损伤中作用的研究尚未有报道，最新的数据证实IF1与小胶质细胞炎症及肠道炎症相关［16-17］。尤其值得关注的是，Lefebvre等［18］研究发现，敲除IF1后的HeLa细胞，募集到受损线粒体的parkin数量明显减少，在HeLa细胞中过表达HSPA1L能增强突变型的parkin募集到受损线粒体上，其结果表明IF1对parkin在受损线粒体的募集具有调节作用，因此IF1有可能通过调控parkin参与调节线粒体自噬。所以本实验意在研究IF1在脂多糖（lipopolysa
ccharide，LPS）刺激肺泡巨噬细胞对炎症反应和线粒体自噬的影响，以探讨其抑制肺泡巨噬细胞释放炎症因子的作用机制。
材料和方法
1　细胞与主要试剂
小鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S）由北纳生物公司提供；RPMI-1640液体培养基和胎牛血清购自Wi‑sent；脂多糖购自Sigma；RT-qPCR逆转录及定量试剂购自Vazyme；CRISRP activation质粒（sc-419264-ACT）购自Santa Cruz；转染试剂Lipofectamine 3000和MitoSOX™ Red试剂购自Invitrogen；转染培养基Opti-MEM购自Gibco； IF1蛋白（#8528）、自噬相关蛋白LC3（#43566）、线粒体膜蛋白TOM20（#42406）、线粒体自噬蛋白parkin（#4211）和内参蛋白GAPDH（# 5174）抗体及抗兔或抗鼠Ⅱ抗购自Cell Signaling Technology；JC-1试剂盒和Mito-Tracker Red探针购自上海碧云天生物技术有限公司；山羊抗兔IgG （H+L）荧光Ⅱ抗Alexa Fluor® 488-AffiniPure购自Jackson；ELISA试剂盒购自Elabscience；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司根据设计合成，见表1。
2　主要方法
2.1　细胞培养与分组　细胞培养液是BMPI-1640培养基添加10%胎牛血清，不添加任何抗生素组成；
表1　RT -qPCR引物序列
Table 1.　Sequences of the primers for RT-qPCR Name
IF1
GAPDH
Primer sequence
Forward： 5′-GGTGTCTGGGGTATGAAGGTC-3′
Reverse： 5′-CCTTTTCTCGTTTTCCGAAGGC-3′
Forward： 5′-TAAAACCCGGCGGCGCA-3′
Reverse： 5′-ATCCATGGCGAACTGGTGG-3′
reactive oxygen species是什么意思
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细胞放置于含有细胞培养液的培养皿中，最终将培养皿放置入37 ℃、5% CO2条件下的培养箱中。用
CRISRP activation质粒转染构建了过表达IF1的MH-S细胞系。通过转染、筛选、细胞培养获得过表达IF1细胞。随后将MH-S细胞分为4组，正常对照（con‑trol）组、LPS处理组、LPS+ACT-NC（normal control）组和LPS+ACT-IF1组；用PBS稀释LPS；根据文献经验在细胞培养液中加入LPS（10 mg/L）处理12 h［7］。最终观察IF1对LPS处理后的肺泡巨噬细胞的影响。LPS处理12 h后收集细胞，分别提取总RNA和蛋白。进一步检测肺泡巨噬细胞类型和线粒体功能状态。
2.2　CRISRP activation质粒转染构建过表达IF1细胞　转染前24 h以每孔1.5×105个细胞将MH-S细胞接种到6孔板中。准备A液（IF1质粒DNA+P3000+ Opti-MEM）和B液（Lipo3000+Opti-MEM），室温静置5 min；而后将A、B液混合静置20 min，后将A、B混合液滴加到细胞培养液中，轻轻晃动混匀放置培养箱；转染12 h后第一次更换培养液，后面视细胞状态更换培养液，一共需培养48 h；48 h后通过提取RNA及蛋白来验证过表达。NC组步骤和上述相同，将A液中的IF1质粒DNA换成NC质粒DNA。
2.3　RT-qPCR检测IF1的表达　LPS刺激细胞12 h 后，去除细胞上清液，用PBS洗涤细胞后，在每孔细胞中加入1 mL Trizol试剂分离出总RNA，随后将其逆转录成cDNA。在以下条件下进行荧光定量PCR：95 ℃ 5 min；95 °C 10 s，60 ℃ 20 s 40次循环。用2-ΔΔCt 值计算定量评价。
2.4　ELISA检测细胞炎症因子　同样用LPS刺激细胞12 h后，收集细胞培养液于2~8 ℃、1 000×g离心2
0 min去除杂质及细胞碎片，按照说明书方法分别检测3种不同细胞炎症因子的含量。最后用酶标仪在450 nm波长处测量每个孔的吸光度（A）。
2.5　Western blot检测IF1蛋白表达及相关线粒体自噬蛋白水平　细胞接受LPS处理12 h后，去除细胞培养液，加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取细胞总蛋白，最终加入Loading Buffer加热，于−20 ℃保存。总蛋白用12.5% SDS-PDGE分离90 min，而后在250 mA、120 min条件下转到PVDF膜上，在5%牛血清白蛋白中封闭1 h，然后根据所需分子量裁剪PVDF膜，最后按照分子量与以下Ⅰ抗（抗兔或鼠Tom20、LC3B、parkin和GAPDH抗体，均1∶1 000）在
4 ℃冰箱内孵育过夜：。次日用抗兔或抗鼠Ⅱ抗（1∶
5 000）作用于膜上1 h，用ECL成像分析仪器检测发光强度，并在图像分析系统上分析。
2.6　JC-1染　采用JC-1试剂盒检测MMP，按照试剂盒说明书配制JC-1染工作液及JC-1染缓冲液（1×）。6孔板中LPS处理细胞后，去除细胞培养液用PBS洗涤不同组的细胞，然后加入1 mL细胞培养液与1 mL JC-1染工作液充分混匀，在37 ℃中避光孵育30 min；37 ℃孵育结束后，吸除上清用JC-1染缓冲液（1×）洗涤两次；最后加入2 mL细胞培养液，用荧光显微镜检测不同组的JC-1单体（绿荧光）与
JC-1聚合物（红荧光）。
2.7　活性氧荧光分析　用Mito SOX™ Red线粒体氧化物指示剂检测细胞线粒体中ROS水平。利用氧化物氧化 Mito SOX™ Red 试剂，产生红荧光。使用前按Mito SOX™ Red试剂说明书加入适量DMSO溶解试剂粉，制成5 mmol/L染原液，置于−20 ℃黑暗中保存。LPS处理细胞后，去除原细胞培养液，用PBS洗涤后加入新的细胞培养液，而后在细胞培养液中同时加入Mito SOX™ Red（1∶1 000）和Hoechst33342（1∶5 000，用于染细胞核）于37 ℃培养箱内孵育30 min，孵育结束后用PBS洗涤3次，加入无酚红培养液1 mL，最后使用荧光显微镜观察。2.8　荧光共定位检测　Mito-Tracker Red是用来标记线粒体的红荧光染料，按照说明书将其配制成200 µmol/L的储存液，置于−20 ℃保存。实验开始前将细胞爬片放入24孔板中，MH-S细胞种在细胞爬片上，加入培养液，而后在细胞培养液中加入Mito Tracker Red（1∶2 000）在37 ℃培养箱中孵育30 min，标记线粒体。孵育结束后用HBSS缓冲液洗涤后在避光环境下用4%多聚甲醛固定30 min，固定结束后用HBSS清洗2次，加入约含0.2% TritonX-100的PBS室温通透10 min，然后用PBS清洗，5%牛血清白蛋白封闭1 h，与兔抗LC3 Ⅰ抗反应过夜。次日用PBS清洗Ⅰ抗，然后爬片进一步用Alexa Fluor 488羊抗兔抗体避光孵育1 h。切片用PBS洗涤后，用1∶1 000 DAPI染10 min，PBS洗涤，加入抗荧光猝灭剂，贴在显微镜载玻片上。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞。每种荧光染料的激发和发射波长都是根据说明书选择的。
3　统计学处理
所有统计分析用GraphPad Prism 8.0和SPSS 22.0软件进行。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。
使用单因素方差分析或t检验对实验结果进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1　IF1在肺泡巨噬细胞中的变化
通过RT-qPCR与Western blot检测发现LPS刺
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激肺泡巨噬细胞后IF1 mRNA 和蛋白相对表达量降
低（P <0.01）。进一步用质粒转染激活IF1后用LPS 刺激肺泡巨噬细胞发现IF1的mRNA 和蛋白相对表
达量升高（P <0.01），说明IF1质粒转染成功。见图1A 、1B 。
2　上调IF1抑制肺泡巨噬细胞分泌炎症因子为了观察IF1对细胞炎症的影响，本实验采用
ELISA 双抗夹心法检测细胞培养液上清中炎症因子分泌情况。与control 组相比，LPS 组肺泡巨噬细胞分泌的TNF -α、IL -1β和IL -6水平升高（P <0.01）；与
LPS 组相比，LPS+ACT -NC 组肺泡巨噬细胞中炎症因
子分泌无差异；与LPS+ACT -NC 组相比，上调IF1后，LPS+ACT -IF1组肺泡巨噬细胞分泌的 TNF -α、IL -1β和IL -6水平降低（P <0.01），结果说明IF1可以抑制细胞炎症因子的分泌。见图2
。
Figure 1.　The mRNA and protein levels of IF1 in MH -S cells were detected by RT -qPCR and Western blot. The IF1-overexpressing
MH -S cell line was produced using the CRISPR activation system ， and then macrophages were stimulated with LPS （10 mg/L ） for 12 h. A ： the changes of IF1 mRNA expression were detected by RT -qPCR ； B ： the protein level of IF1 was assessed
by Western blot. Mean±SD. n =3. **P <0.01 vs  control group ； ##P <0.01 vs  LPS+ACT -NC group.
图1　RT -qPCR 及Western blot 检测MH -S 细胞中IF1的mRNA 及蛋白水平
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3　过表达IF1改善肺泡巨噬细胞线粒体MMP 和ROS 水平
为了进一步研究IF1对线粒体功能的影响，我们利用JC -1试剂盒来检测细胞的MMP ，并用Mito SOX ™ Red 染检测细胞线粒体中ROS 产生，与control 组
比较，LPS 组MMP 明显下降，且ROS 水平明显升高；与LPS+ACT -NC 组比较，LPS+ACT -IF1组肺泡巨噬细胞膜电位及ROS 水平明显改善。这些结果表明上调IF1能够帮助线粒体膜电位的恢复并且能够抑制细
胞线粒体内ROS 的产生。见图3。4　过表达IF1对LPS 诱导的肺泡巨噬细胞中LC3、TOM20和parkin 蛋白表达的影响
为了研究肺泡巨噬细胞中IF1与线粒体自噬的关系，我们检测了自噬蛋白LC3、线粒体外膜蛋白TOM20及线粒体自噬蛋白parkin 的变化。结果表明，在LPS 刺激下parkin 水平以及LC3-II/LC3-I 比值明显升高，线粒体膜蛋白TOM20水平明显下降（P <0.01），说明LPS 促进了肺泡巨噬细胞的线粒体自噬；而与LPS+ACT -NC 组比较，LPS+ACT -IF1组肺泡巨噬细胞中的parkin 水平和LC3-II/LC3-I 比值下降，同时TOM20蛋白水平升高（P <0.01），由此说明过表达IF1能够抑制LPS 诱导的线粒体自噬。见图4。5　过表达IF1对LPS 诱导的肺泡巨噬细胞中线粒体与LC3蛋白共定位的影响
为了更加形象地观察线粒体自噬的变化，我们采用Mito Tracker 染定位线粒体，同时染定位细胞中的LC3蛋白，进行荧光共定位检测。结果显示，与control 组比较，LPS 刺激后Mito Tracker 与自噬蛋白LC3共定位明显增加，表示LPS 促进了肺泡巨噬细胞的线粒体自噬；而与LPS+ACT -NC 组比较，LPS+ACT -IF1组的共定位明显减弱。因此说明过表达IF1
抑制了肺泡巨噬细胞线粒体自噬。见图5。
讨论
当外来微生物入侵机体时，单核-巨噬细胞通过
Toll 样受体识别微生物的病原体相关分子模式，然后
通过一系列的信号转导使核因子-kappaB 活化，导致全身炎症反应综合征。在此过程中肺内巨噬细胞被过度激活而失控性释放细胞因子，一些早前最具有生物活性的早期炎症因子，如IL -6、IL -1β和TNF -α，形成肺内炎症“瀑布”反应，则可导致ALI ［19］。ALI 的应基于针对其发病机制［20］。由于肺泡巨噬细胞
的广泛存在和其在维持免疫稳态和调节炎症反应中
的作用，巨噬细胞应被探索作为的靶点［7， 21］
。在
本研究中，我们使用LPS 刺激MH -S 细胞作为体外炎症模型，发现LPS 刺激后巨噬细胞形态发生明显改变，细胞分泌炎症因子明显增加。
在LPS 刺激的巨噬细胞中，线粒体自噬可通过清除受损线粒体，降低细胞质中线粒体DNA （mito‑chondrial DNA ， mtDNA ），减少炎症因子的释放，从而
有助于ALI 的康复［22-23］。Mannam 等［24］发现丝裂原活化蛋白激酶激酶3（mitogen -activated protein kinase kinase 3， MKK3）可与PINK 和parkin 相互作用抑制线粒体自噬，在脓毒症小鼠敲除MKK3后，线粒体自
噬上调，ROS 产生明显减少，死亡率下降。然而，适度的线粒体自噬才是有益的。有研究发现慢性阻塞性肺病的发病机制与过度的线粒体自噬相关［25］。也有研究表明在在神经系统急性疾病中，如卒中、缺血
性和缺氧性脑损伤、癫痫和创伤性脑损伤，线粒体自噬被激活，自噬和自噬流之间的失衡导致自噬机制异常［26］。有实验使用A549细胞及RAW264.7细胞作为体外细胞炎症或凋亡模型，他们发现LPS
刺激Figure 2.　Changes in inflammatory factors in cell supernatants were measured by ELISA. The IF1-overexpressing MH -S cell line was
produced using the CRISPR activation system and then stimulated with LPS （10 mg/L ） for 12 h. ELISA was used to detect the inflammatory response of macrophages. Mean±SD. n =3. **P <0.01 vs  control group ； ##P <0.01 vs  LPS+ACT -NC group.
图2　ELISA 法测定细胞上清液中炎症因子的变化
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