植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ  　２００９，　４４　（１）：　１０３−１０６，　ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ
收稿日期：　２００７－１２－１１；　接受日期：　２００８－０２－１９基金项目：　国家自然科学基金（Ｎｏ．３０５３０４３０）＊　通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：　ｓｏｎｇｃｐ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
．技术方法．
植物细胞过氧化氢的测定方法
张小莉１，２，　王鹏程１，　宋纯鹏１＊
１
河南大学生命科学学院，　河南省植物逆境生物学重点实验室，　开封  ４７５００１；　２河南省中医学院，　郑州　４５０００８
摘要    过氧化氢是重要的活性氧之一，　激素等发育信号和胁迫刺激可以诱导细胞内Ｈ２Ｏ２的产生和积累，　继而调控植物的气孔运动、生长发育、衰老和逆境应答等诸多生理过程。准确测定植物细胞内Ｈ２
Ｏ２的含量及变化模式是系统研究Ｈ２Ｏ２信号转导及其生物学功能的一个关键技术。该文以拟南芥为实验材料，　介绍了目前植物细胞Ｈ２Ｏ２的主要测定方法，　包括激光共聚焦显微检测、紫外分光光度计检测和ＤＡＢ组织染，　在此基础上比较分析了上述方法在灵敏度、检测范围、定量、成本以及耗时等方面的差异，　为相关研究选择合适的Ｈ２Ｏ２检测技术提供参考。
关键词    激光共聚焦显微成像，　ＤＡＢ染，　过氧化氢，　分光光度法
张小莉，　王鹏程，　宋纯鹏　（２００９）．　植物细胞过氧化氢的测定方法．　植物学报　４４，　１０３－１０６．
过氧化氢是活性氧（ａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，　ＡＯＳ）的一种，　多种外界刺激或细胞内信号分子都可以导致细胞内Ｈ２Ｏ２的积累。Ｈ２Ｏ２不仅具有损伤生物大分子、产生细胞毒害的能力，　而且还被证明可以作为信号分子，　在气孔运动、生物和非生物胁迫应答、细胞程序性死亡、激素应答以及生长发育调控过程中起重要作用（Ｎｅｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２；　Ｌａｌｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００４；　Ｃｈｅｎｇ　ａｎｄ　Ｓｏｎｇ，２００６）。研究发现，　细胞内Ｈ２Ｏ２浓度的变化对于Ｈ２Ｏ２介导下游生理过程是必需的。例如，　Ｈ２Ｏ２的积累对于ＡＢＡ诱导的气孔关闭是必需的，　而且在这一过程中，Ｈ２Ｏ２还能调控Ｃａ２＋信号系统、胞质碱化以及Ｋ＋通道的变化（Ｐｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００；　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　
２００１ａ，　２００１ｂ）。病原菌侵染和激发子的刺激也可以引起Ｈ２Ｏ２的产生，　而且这一过程具有双时相的特征，　不同时相所偶联的生物学过程也不同（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）。这些结果都证明，Ｈ２Ｏ２在细胞内浓度的升高和降低以及变化模式可能介导了不同的信号转导途径，　并调控相应生长发育、胁迫应答等生物学过程（Ｃｈｅｎｇ　ａｎｄ　Ｓｏｎｇ，　２００６）。因此，　准确测定植物细胞内Ｈ２Ｏ２的含量以及变化模式成为系统研究Ｈ２Ｏ２信号转导及生物学功能的一个关键技术。本文以拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｌ．）为实验材料，　介绍
并比较分析了目前植物细胞Ｈ２Ｏ２的主要测定方法，　包括激光共聚焦显微检测、紫外分光光度计检测和ＤＡＢ组织染等技术。
１    材料和方法
１．１    材料
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｌ．）种子清洗消毒后点于ＭＳ培养基上，　在４°C 春化２－３天后，　放置于材料室进行培养。生长的光暗周期为１６小时光照／８小时黑暗，培养温度为（２０±２）°C ，　光照强度为１２０－１５０　µｍｏｌ．ｍ－２．ｓ－１，　相对湿度为８０％。待幼苗长出４－６片叶子后，移至营养土中继续生长，　根据需要在适宜的时间取其不同部位
（如叶片、根等）作为实验材料。
化学试剂Ｈ２ＤＣＦＤＡ（ｃａｒｂｏｘｙ－２，７－ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆ－ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ）和ＤＡＢ（３，３－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎ）购自Ｓｉｇｍａ公司。其它试剂采用国产分析纯。１．２    方法
１．２．１    激光共聚焦显微检测
剪取生长状态好的叶片，　用蒸馏水洗净，　撕取下表皮，　用
104植物学报    ４４（１）    ２００９
毛笔轻轻刷去叶肉细胞，　在Ｔｒｉｓ缓冲液（１０　ｍｍｏｌ
．Ｌ－１Ｔｒｉｓ，　５０　ｍｍｏｌ
．Ｌ－１　ＫＣｌ，　ｐＨ　６．１）中培养。探针孵育时从Ｔｒｉｓ缓冲液中取出表皮条，　放入５　ｍＬ探针负载缓冲液（１０　ｍｍｏｌ
．Ｌ－１　Ｔｒｉｓ，　５０　ｍｍｏｌ．Ｌ－１　ＫＣｌ，　ｐＨ　７．２）中培
养，　加入５０　ｍｍｏｌ．Ｌ－１　Ｈ
２
ＤＣＦＤＡ溶液５　ｍＬ（溶于二甲
亚砜，　小包装冷冻保存），　混匀，　室温避光孵育１０－１５分钟。将负载Ｈ２ＤＣＦＤＡ的表皮条用新鲜负载缓冲液漂洗２次，　以洗去细胞表层多余的探针，　然后用盖玻片迅速将表皮条固定在显微镜载物台上，　用激光共聚焦扫描显微镜观察。激光共聚焦扫描显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，　Ｆｌｕｏｖｉｅｗ１０００）的工作条件为：　激发波长４８８　ｎｍ，　发射波长　５１５－５３０　ｎｍ，　Ｐｏｗｅｒ　５％，　中速扫描，　软件为ＦＶ１０－ＡＳＷ１．６　Ｖｉｅｗｅｒ。记录ＡＢＡ处理前后细胞内的荧光变化，ＡＢＡ处理浓度为１　µｍｏｌ
．Ｌ－１。每个实验重复５－１０次。荧光变化的统计分析参考Ｚｈａｎｇ等（２００１ａ）的方法并略做修改。
１．２．２    紫外分光光度计检测　
取生长良好的叶片，　撕取下表皮，　用毛笔轻轻刷去叶肉细胞，　切成０．５　ｃｍ×１　ｃｍ的表皮条，　在Ｔｒｉｓ缓冲液中培养。每次实验取预处理过的表皮条１０个，　分别放置于含１　µｍｏ
ｌ
．Ｌ－１　ＡＢＡ、１　µｍｏｌ．Ｌ－１　ＡＢＡ和２０　Ｕ．ｍＬ－１过氧化氢酶（ＣＡＴ）以及不含ＡＢＡ和ＣＡＴ的０．５　ｍＬ　Ｔｒｉｓ缓冲液的石英比皿中。处理５分钟后，　利用紫外分光光度计测定吸光值（波长为２４０　ｎｍ）。同时以缓冲溶液作为对照，　以标准Ｈ２Ｏ２浓度梯度溶液制作标准曲线，　获得Ｈ２Ｏ２浓度与吸光值的回归曲线。每个实验重复３－６次。数据的统计分析及详细实验方法参考夏金婵（２００５）的方法。
１．２．３    ＤＡＢ组织染
根据需要取植物组织的不同部位，　如叶片、根或整株苗，　用蒸馏水洗净后将其置于１．５　ｍＬ离心管中，　加入１０µｍｏｌ．Ｌ－１　ＡＢＡ　２８°C避光处理３０分钟。取适量ＤＡＢ染液（１　ｍｇ
．ｍＬ－１，　ｐＨ　３．８），　用ＮａＯＨ调ｐＨ值至５．８，　分别加入预处理的植物组织，　２８°C避光保存８小时。随后吸去各管染液，　加入８０％乙醇，　沸水浴数分钟，　吸出各管液体，　加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿完全脱去为止，　再次吸出各管液体，　加入无水乙醇，　置于４°C冰箱内保存一段时间后观察（Ｇｕａｎ　ａｎｄ　Ｓｃａｎｄａｌｉｏｓ，２０００）。
２    结果与分析
２．１    激光共聚焦显微技术
经探针孵育的实验材料在激光共聚焦显微镜下可观察到明显的绿荧光，　此时加入ＡＢＡ，　即可看到荧光逐渐增强（图１），　通过软件可以记录一组图片。
２．２    紫外分光光度技术
依据Ｈ２Ｏ２在波长２４０　ｎｍ处有强烈吸收光谱的特性，　利用紫外光吸收可以检测溶液内Ｈ２Ｏ２的产生（图２Ａ）。结合标准浓度Ｈ２Ｏ２　吸光度的标准曲线（图２Ｂ），　可以定量分析待测样品中的Ｈ２Ｏ２含量。
２．３    ＤＡＢ组织染技术
该技术是对Ｈ２Ｏ２进行原位定位染的方法。ＤＡＢ可以与Ｈ２Ｏ２在产生处发生反应，　形成红褐斑点，　因此利用ＤＡＢ染可以对叶片或植株进行组织化学原位检测，通过观察产生的斑点便可检测过氧化氢的聚集情况（图３）。
图１    利用激光共聚焦显微成像技术检测保卫细胞内Ｈ２Ｏ２浓度变化　（Ｂａｒ＝２　ｍｍ）
Ｆｉｇｕｒｅ　１    Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈ２Ｏ２　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｃｏｎｆｏｃａｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　（Ｂａｒ＝２　ｍｍ）
１０５
张小莉等：　植物细胞过氧化氢的测定方法３    讨论
目前，　上述３种方法都被广泛用于植物Ｈ２Ｏ２含量的测定。利用荧光探针的激光共聚焦检测技术能够实时比较细胞和局部组织内Ｈ２Ｏ２的含量。这种方法灵敏度高，时间短，　尤其能够动态检测细胞内Ｈ２Ｏ２浓度的变化，　在信号转导研究中得到广泛的应用。但其不足之处也很明显，　特异性不强，　细胞内的其它活性氧也可能被标记检测，　而且需要借助Ｈ２Ｏ２专一的荧光探针和较昂贵的仪器，　因此其应用程度受限制。紫外分光光度计检测法是一种快速简易的测定方法，　所用试剂价格便宜，　通过制作标准曲线，　可以准确定量测定细胞内Ｈ２Ｏ２的浓度，　既可满足教学实验的需要，　也适合叶片中Ｈ２Ｏ２含量的定量
测定，　但其不足之处是灵敏度不高。ＤＡＢ组织化学染法能够较快速地检测植株或组织内Ｈ２Ｏ２的含量，　其优势在于具有组织特异性，　成本较低，　但是该法灵敏度不高，因而只能作为一种定性检测Ｈ２Ｏ２的方法。此外，　利用ＣｅＣｌ３染和电子显微镜方法也可以检测Ｈ２Ｏ２的产生（Ｓ
ｌｏｃｕｍ　ａｎｄ  Ｆｕｒｅｙ，　１９９１），　其优势在于能够在亚细胞水平上研究Ｈ２Ｏ２产生的部位，　但检测过程较复杂，　周期长，　而且需要电子显微镜等大型仪器设备，　难以得到广泛的应用。最近有文献报道利用氧化还原敏感的绿荧光蛋白（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，　ｒｏＧＦＰ）也能够实时定量地检测细胞内活性氧的浓度变化。该法灵敏度高，　定量准确，　并能够进行动态检测，　但由于需要转基因或杂交的方法才能引入绿荧光蛋白，　实验周期长，　在一定程度上限制了其广泛应用（Ｈａｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００４；　Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）。我们对上
述研究方法在灵敏度、检测范围、能否定量、成本和耗费时间等方面进行综合比较（表１），　为今后在特定研究中选择合适的Ｈ２Ｏ２检测方法提供参考。
图２    通过紫外光吸收检测表皮条Ｈ２Ｏ２浓度的变化
（Ａ）　Ｈ２Ｏ２浓度与紫外光吸收标准曲线；　（Ｂ）　ＡＢＡ和ＣＡＴ处理对Ｈ２Ｏ２和紫外光吸收的影响
Ｆｉｇｕｒｅ　２    Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈ２Ｏ２　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅＵＶ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
（Ａ）　Ｌｉｎｅａｒ　ｆｉｔ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｈ２Ｏ２　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；　（Ｂ）　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＡＢＡ　ａｎｄ　ＣＡＴ　ｏｎ　Ｈ２Ｏ２　ａｎｄ　ＵＶ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
图３    通过ＤＡＢ染检测植物体内Ｈ２Ｏ２浓度的变化
Ｆｉｇｕｒｅ　３    Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈ２Ｏ２　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇＤＡＢ　ｓｔａｉｎｉｎｇ
表１    植物细胞Ｈ２Ｏ２检测方法的比较
Ｔａｂｌｅ　１    Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈ２Ｏ２－ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ
Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ＲａｎｇｅＱｕａｎｔｉｆｉａｂｉｌｉｔｙＣｏｓｔＴｉｍｅ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇＣｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙＨｉｇｈＣｅｌｌ，　ｔｉｓｓｕｅ
ＲｅｌａｔｉｖｅＨｉｇｈＳｈｏｒｔ　（１－２　ｈ）ＤＡＢ　ｓｔａｉｎｉｎｇＬｏｗＴｉｓｓｕｅ，　ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔＮｏＬｏｗＳｈｏｒｔ　（８－２４　ｈ）Ｈ２Ｏ２　ＵＶ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅＭｉｄｄｌｅＴｉｓｓｕｅＹｅｓＬｏｗＳｈｏｒｔ　（１－２　ｈ）
ｒｏＧＦＰ
ＨｉｇｈＣｅｌｌ，　ｔｉｓｓｕｅＲｅｌａｔｉｖｅＭｉｄｄｌｅＶｅｒｙ　ｌｏｎｇ　（３－５　ｍｏｎｔｈ）ＣｅＣｌ３　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
Ｍｉｄｄｌｅ
Ｃｅｌｌ
Ｎｏ
Ｈｉｇｈ
Ｌｏｎｇ　（１－２　ｗｅｅｋ）
106植物学报    ４４（１）    ２００９
参考文献
夏金婵，　苗雨晨，　宋纯鹏，　苗琛　（２００５）．　紫外分光光度技术测定植物细胞中Ｈ２Ｏ２的含量．　四川大学学报（自然科学版）　４２，　１２６３－１２６５．
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reactive oxygen species是什么意思Ｎｅｉｌｌ　Ｓ，　Ｄｅｓｉｋａｎ　Ｒ，　Ｈａｎｃｏｃｋ　Ｊ　（２００２）．　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ．　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ　５，　３８８－３９５．
Ｐｅｉ　ＺＭ，　Ｍｕｒａｔａ　Ｙ，　Ｂｅｎｎｉｎｇ　Ｇ，　Ｔｈｏｍｉｎｅ　Ｓ，　Ｋｌｕｓｅ
ｎｅｒ　Ｂ，　ＡｌｌｅｎＧＪ，　Ｇｒｉｌｌ　Ｅ，　Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ　ＪＩ　（２０００）．　Ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｍｅｄｉａｔｅ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｇｕａｒｄｃｅｌｌｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　４０６，　７３１－７３４．
Ｓｌｏｃｕｍ　ＲＤ，　Ｆｕｒｅｙ　ＭＪ　３ｒｄ　（１９９１）．　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ｃｙ－ｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉａｍｉｎｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙａｍｉｎｅ　ｏｘｉｄａｓｅｓ　ｉｎｐｅａ　ａｎｄ　ｍａｉｚｅ　ｔｉｓｓｕｅｓ．　Ｐｌａｎｔａ　１８３，　４４３－４５０．
Ｚｈａｎｇ　Ｘ，　Ｚｈａｎｇ　Ｌ，　Ｄｏｎｇ　ＦＣ，　Ｇａｏ　ＪＦ，　Ｇａｌｂｒａｉｔｈ　ＤＷ，　Ｓｏｎｇ　ＣＰ（２００１ａ）．　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｉｎ－ｄｕｃｅｄ　ｓｔｏｍａｔａｌ　ｃｌｏｓｕｒｅ　ｉｎ　Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１２６，　１４３８－１４４８．
Ｚｈａｎｇ　Ｘ，　Ｍｉａｏ　ＹＣ，　Ａｎ　ＧＹ，　Ｚｈｏｕ　Ｙ，　Ｓｈａｎｇｇｕａｎ　ＺＰ，　Ｇａｏ　ＪＦ，Ｓｏｎｇ　ＣＰ　（２００１ｂ）．　Ｋ＋　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｉｎｈｉｂｉ
ｔｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘ－ｉｄｅ　ｍｅｄｉａｔｅ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　Ｖｉｃｉａ　ｇｕａｒｄ　ｃｅｌｌｓ．　ＣｅｌｌＲｅｓ　１１，　１９５－２０２．
Methods of Detecting Hydrogen Peroxide in Plant Cells
Xiaoli Zhang1,2 , Pengcheng Wang2 , Chunpeng Song1*
1Laboratory of Plant Stress Biology, Department of Biology, Henan University, Kaifeng 475001, China
2Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China
Abstract    Environmental stresses or plant hormones trigger the production and accumulation of H2O2, a reactive oxygen species, which regulates stomatal movement, growth and development, senescence and stress resistance. To study the signaling and biological function of H2O2, methods to detect H2O2 concentration and variety are necessary. In this study, we compared three H2O2 detection methods　— confocal microscopy of fluorescent probes, DAB staining and spectrophotometry　— for specificity, sensitivity, quantifiability, time of use, and cost. This work may be helpful in finding an optimal H2O2 detection method for related research.
Key words    confocal, DAB staining, hydrogen peroxide, spectrophotometry
Ｚｈａｎｇ　ＸＬ，　Ｗａｎｇ　ＰＣ，　Ｓｏｎｇ　ＣＰ　（２００９）．　Methods of detecting hydrogen peroxide in plant cells．　Ｃｈｉｎ　Ｂｕｌｌ　Ｂｏｔ　４４，　１０３−１０６．
＊　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｓｏｎｇｃｐ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
（责任编辑：　白羽红）

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