线粒体在肺纤维化发病机制中的作用及进展
肺间质纤维化(简称肺纤维化)是最常见的肺间质疾病,也是呼吸系统最严重疾病之一。目前认为氧化应激和细胞凋亡是肺纤维化的主要发病机制。氧化应激是指活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)造成的氧化损伤。即当自由基的产生过多或体内抗氧化系统出现故障,体内氧自由基代谢就会出现失衡,自由基蓄积过多,攻击机体,导致可能的损害。
线粒体在细胞能量代谢、细胞死亡调控、神经递质合成、脂肪酸氧化等过程中发挥重要作用。线粒体在氧化磷酸化过程中可产生一定量的自由基,但由于生物体内同时存在抗氧化防御体系,在生理条件下可维持动态平衡。如果这种平衡被破坏,线粒体损伤可引起一系列的细胞功能障碍,参与疾病的发生、发展过程。氧化应激损伤线粒体参与肺纤维化的形成日益受到重视。
1 线粒体结构和功能
线粒体是真核细胞的重要细胞器,线粒体有内外两层膜封闭,包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。
线粒体外膜包含目前研究最广泛的线粒体通道:电压依赖性阴离子通道(Vohage-depede ntanion channel,VDAC)。外膜上的孔道是细胞凋亡的基本要素[1]。研究发现,在细胞凋亡的过程中发现细胞素C从线粒体间膜转移到细胞质。线粒体内膜通透性小,通道包括:Ca2+单向转运通道、通透性转孔、去偶联蛋白、KATP、Kca、内膜阴离子通道。
线粒体具有氧化磷酸化、传递电子、贮存Ca2+、能量代谢、抗活性氧等重要生理作用。是细胞内氧化应激的源头,也是细胞凋亡的主要位点。
2 线粒体损伤性改变
数量的改变:线粒体的平均寿命约为10 d。衰亡的线粒体可通过保留的线粒体直接分裂为二,予以补充。在病理状态下,线粒体的增生实际上是对慢性非特异性细胞损伤的适应性反应或细胞功能升高的表现;线粒体数量减少则见于急性细胞损伤时线粒体崩解或自溶的情况。
大小改变:最常见的是线粒体肿大,分为基质肿胀和嵴型肿胀,以前者为常见。结构改变:线粒体嵴是能量代谢的明显指征,嵴和酶的平行增多反映细胞功能负荷加重,为一种适应状态的表现;反之,如嵴的膜和酶的增多不平行,则是细胞浆适应功能障碍的表现,此时细胞功能并不升高。
3 线粒体氧化应激与细胞内氧化应激
线粒体氧化应激即发生在线粒体内部的氧化与抗氧化失衡。一般认为,线粒体内氧化应激的发生早于细胞内氧化应激。线粒体是ROS的主要产生部位,体内ROS的损伤作用主要由超氧阴离子(O-2)介导,线粒体中O-2主要在呼吸链中产生,包括:①QH是还原型辅酶Q和氧化型辅酶Q的中间产物,呼吸链复合物Ⅲ中的QH可氧化生成O-,这是线粒体中O-2的主要来源;②PKA磷酸化复合物I可使O-2生成增加;③呼吸链中的FAD和FMN在氧化还原反应中产生的半醌自由基可以将一个电子交给O＜SUB＞2＜/SUB＞生成O-2;④生物体内产生的H2O＜SUB＞2＜/SUB＞,如果未能及时清除,则可与过渡金属离子或其他化合物,如ADP-Fe(Ⅱ)反应,产生O-2[2]。线粒体也可生成多种RNS。线粒体一氧化氮合酶(mitochondrialnitricoxidesynthase,mtNOS)催化L-精氨酸生成NO,由于内环境不同,NO可衍生成NO+和NO-,NO和O-2相遇即可生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。ONO-是一种活性很强的自由基,它的性质和OH-近似。
4 线粒体氧化应激与细胞凋亡
细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD),是指机体在生理或病理条件下,启动自身内部机制,经过多途径的信号传递,结束其自身生命的过程。已知有三条
信号通路,其中线粒体凋亡通路细胞凋亡的“中心执行者”[3],线粒体的功能是作为凋亡途径上游与caspase、下游死亡执行器之间连接。凋亡过程中线粒体内发生的最重要事件即其结构和功能的改变,由此产生凋亡相关蛋白释放到胞质[4]。线粒体内膜含有许多促进凋亡因子(death provoting factor,DPF),包括细胞素C(cyt C)、AIF和半胱氨基酸蛋白酶(caspase)等。在氧化应激状态下,气道上皮细胞线粒体膜极性破坏,通透性增加,并且释放细胞素C 和凋亡诱导因子至胞浆中,在ATP 的参与下细胞素C 与凋亡蛋白水解酶活化因子(Apaf-1) 结合,使Apaf-1 之间相互聚合,并与caspase-9 前体形成复合体(即凋亡小体),从而激活caspase-9,活化的caspase-9再激活下游的caspase 酶原-3 、caspase 酶原-6 、caspase 酶原-7等效应酶,并释放细胞素C 进而诱发凋亡反应形成凋亡小体;同时,AIF 从线粒体膜间隙首先转移至细胞质,继而进入细胞核激活DNAase,促使DNA 裂解成片段和胞核中的染质异常凝集[5,6]。从而出现细胞膜破裂、细胞皱缩及分解等凋亡形态[7,8]。
4.1 线粒体通透性转换孔的改变 线粒体通透性转换孔(Mitochondrionpermeability transition pore,MPTP)被称为细胞生死开关,是由电位依赖性阴离子通道即孔蛋白(porin)、腺苷酸移位酶(Adenin nueleotide transloease,ANT)及亲环素D(cyP-D)复合物在内外膜交接处构成的一种孔道复合结构。ANT 位于线粒体内膜,VDAC 位于线粒体外膜, CyP2D 存在于线粒体内室。
VDAC 和ANT 并置在线粒体内外膜的相对应接触位点上, 它们三者通过相互之间的亲和力, 而连接成一个稳定的复合体结构。Boya 等研究发现PT 是许多凋亡通路的关键步骤[9]。PT孔可导致线粒体电子传递链与氧化磷酸化解偶联、ATP 合成下降、线粒体内膜电位丧失、Ca2+外流、还原性谷胱甘肽和NADPH2 减少、细胞内活性氧增多、凋亡诱导因子( apop to sis inducedfacto r,A IF) 和细胞素C 释放, 从而启动细胞凋亡程序, 激活细胞内核酸内切酶、蛋白酶, 发生细胞凋亡[10]。目前研究认为, 线粒体PT 孔的开放是引起细胞凋亡发生的直接原因。PT 孔主要是通过线粒体内膜电位的变化、氧化应激和激动剂与拮抗剂之间的相互作用来进行调控。Ca2+ 、Pi、自由基等氧化因子、Bcl-2、Bax、等可以诱导PT reactive oxygen species是什么意思孔开放,自由基则作用于ANT 的硫醇并使之氧化, 从而引起PT 孔开放[12]。
4.2 ROS 细胞内活性氧(ROS) 来源于两条途径: 黄嘌呤氧化酶途径和线粒体呼吸链途径。在病理条件下线粒体呼吸链是产生ROS 的重要源泉。Haworth 和Hunter 发现ANT 含有硫醇结构,过氧化物可能通过氧化MPTP 孔上的硫醇而诱导MPTP 开放[12]。孔道中-S-S- 和-s-As-s- 结构导致MPTP开放,-SH2 和-SH 则使MPTP 关闭。Ding 等认为,ROS 可能是通过氧化MPTP 上的2 个氧化还原敏感位点:二硫键部位(可能是GSH 库);吡啶核苷酸库,(NADH 或NAD+) 和(NADPH/NADP+)。还有一种可能的机制是ROS 作为第二信使通过Capase 和Bcl-
2 调控MPTP。MPTP 开放时,由于其孔径较大,不仅允许质子在膜两侧达到平衡,也允许呼吸链作用的底物在细胞质与基质间达到平衡。跨膜质子梯度的崩溃使呼吸链的呼吸速率达到最大值,快速消耗氧导致活性氧产生下降和MPTP的关闭。病理条件下氧自由基生成增加,过高的ROS 持续积累导致MPTP 的持续开放。
4.3 Bcl-2、Bax基因及相关蛋白 Bcl-2 基因家族是细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用的基因家族,其中Bcl-2 、Bax 是该家族中最具代表性的抑制和促进气道上皮细胞凋亡的基因。 Bcl-2 基因又称凋亡抑制基因,是从滤泡性非霍奇金淋巴瘤细胞中分离出来的一种癌基因,主要分布于线粒体外膜的胞浆面。人Bcl-2蛋白由4个Bcl-2同源结构域(BH1～BH4)、α2螺旋环(loop)和跨膜锚定区(TM)构成。正常情况下,Bcl-2发挥蛋白降低线粒体膜通透性的作用。机制如下:①作用于膜通透性转运孔(PT孔)的有关蛋白,阻止PT孔的开放及线粒体内物质的外流;②抑制细胞内Ca2+的重新分布,以阻断某些因素的促凋亡过程;③转变成完整的膜蛋白,参与细胞素C的释放:④作为一种抗氧化剂,调节细胞氧化还原状态,阻断氧化作用对细胞组分的破坏[13]。但Bcl-2蛋白的量与线粒体ATP产量正相关。线粒体内发生氧化应激时,其ATP产量明显下降,导致Bcl-2蛋白量明显降低,线粒体膜稳定性下降。
Bax:即Bcl-2相关蛋白X(Bcl-2 associated protein X),是第一个从有t(14;18)易位的人B细胞中发现的与Bcl-2共免疫沉淀的蛋白。Bax蛋白包含Bcl22家族结构特征的BH1、BH2和BH3及C末端的跨膜结构域,不含BH4结构域。Bax蛋白在细胞内膜、细胞浆和细胞核均有分布[4]。与Bcl-2的同源性为40%,故称Bax为Bcl-2家族成员,普遍认为Bax作用于线粒体,增加其外膜通透性。Bax通过调节预先存在的PT孔参与调节线粒体的功能。研究发现,,静止的Bax蛋白从胞浆转位到线粒体而被激活,使PT孔开放并增大到一定程度,导致线粒体的通透性增加和跨膜电位(φ)消失,并且释放细胞素C和AIF到胞浆,而AIF则转移到核内使染质异常凝集和DNA裂解成50kb的片段[14]。Bax作用于PT孔还参与调节线粒体基质中Ca2+、pH值、电荷等的改变和活性氧自由基生成增加,影响呼吸链的正常运行。当Bax大量表达时,细胞对凋亡信号的反应增强,细胞凋亡增多,因此Bax被称为“死亡激动剂”。它本身可以形成多量的Bax-Bax同源二聚体,亦可以和Bcl-2形成异源二聚体Bax-Bcl-2。业已证实细胞内Bcl-2与Bax的比例调节了细胞凋亡的发生,Bax同源二聚体的形成可诱导和促进细胞凋亡,随着Bcl-2蛋白表达量的升高,越来越多的Bax二聚体分开,与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体,从而“中和”了Bax诱导凋亡的作用。Bax与Bcl-2形成的Bax-Bcl-2异源二聚体在诱导细胞凋亡启动过程中起制动作用,可抑制Bax的生物活性,保护细胞不发生凋亡。氧化应激时,Bcl-2蛋白量随着ATP生成的减少而降低,引起Bcl-2与Bax的比例变化,导致线粒体膜通透性改变。
5 氧化应激、细胞凋亡与肺纤维化
肺纤维化以肺泡上皮细胞和内皮细胞凋亡导致肺泡结构的破坏和成纤维细胞增生为特征,目前认为其主要机制为氧化应激和肺泡Ⅱ型细胞凋亡。
细胞凋亡在多种组织器官的发生发育、细胞分化和维持机体平衡状态中发挥重要作用,并参与许多疾病的发生和发展过程。成纤维细胞和内皮细胞凋亡对于急性肺损伤修复十分重要,肺泡上皮细胞凋亡与弥漫性肺泡损坏密切相关。肺纤维化以肺泡上皮细胞和内皮细胞凋亡导致肺泡结构的破坏和成纤维细胞增生为特征。肺纤维化过程起始于肺泡,其肺泡上皮细胞损伤、肺泡炎可能是疾病的早期事件。最近的研究显示,肺泡上皮细胞凋亡在肺炎症/肺纤维化的发生与发展中可能起重要作用。在体内,电镜及DNA片段末端标记证实特发性肺纤维化患者的肺泡Ⅱ型细胞凋亡明显增多,直接导致肺泡塌陷,加速肺纤维化的进展。在体外,活性氧(ROS)和caspase23介导诱导人肺泡I型样细胞WI226、人肺泡II型细胞和大鼠肺泡II型细胞凋亡。
病理情况下,ROS产生的速率大于被清除的速率时,就造成活性氧的蓄积,导致氧化应激,从而引起生物膜磷脂中的多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应、细胞内蛋白及酶变性、DNA氧化损伤;ROS还可作为重要的细胞内信使,活化多条信号转导通路,间接引起组织、细胞损伤。R
OS在细胞损伤中发挥重要作用已成定论。ROS可直接或间接作用于细胞,改变其细胞膜和亚细胞器的结构使其变性、坏死造成细胞损伤、坏死、凋亡及组织炎症反应,产生大量的炎症介质及细胞因子,导致纤维化改变,另一种可能机制为ROS可通过一系列途径直接导致EMS合成增加。
6 结语
综上,线粒体是凋亡的决定性环节,也是细胞内氧化应激的源头,因此其在肺纤维化的形成过程中扮演着重要的角。但是国内外有关线粒体和肺纤维化的关系的研究报道甚少,关于纤维化早期导致线粒体功能和结构改变以及二者的相互作用和影响机制也有待进一步研究。
参 考 文 献

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