基于细胞线粒体能量代谢研究甘草次酸拮抗的心肌毒性作用
作者：何苗，李耀伟，王志琪，周志华，蒲科婷，丛梦静，王嘉星
来源：《湖南中医药大学学报》2021年第11期
        〔摘要〕 目的 从线粒体能量代谢角度研究甘草次酸对的心肌细胞毒性拮抗作用。方法 将大鼠心肌细胞H9c2细胞随机分为10组，即空白组、甘草次酸组、4个组（
120、240、480、960 μmol/L）、4个配伍甘草次酸组（不同浓度分别与60 μmol/L甘草次酸配伍）。采用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）法测定不同浓度给药组对H9c2细胞的影响;采用ELISA法测定各组细胞三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate， ATP）含量、ATP酶活性水平;采用活性氧探针（2，7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate， DCFH-DA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）、线粒体膜电位探针（5，5′6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide， JC-1）检测细胞内线粒体膜电位、钙离子荧光探针（rhod-2 acetoxymethyl ester，Rhod-2AM）检测细胞內钙离子浓度。结果 与单用比较，配伍甘草次酸后心肌细胞的ATP含量、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性升高，ROS含量减少，线粒体膜电位、线粒体内钙离子浓度降低（P<0.01或P<0.05）。结论 甘草次酸可拮抗的心肌细胞毒性，其机制可能是与保护心肌细胞线粒体、增强线粒体能量代谢、维持钙稳态有关。
        〔关键词〕 线粒体能量代谢;;甘草次酸;心肌毒性;钙稳态
        〔中图分类号〕R285.5 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.002
        Glycyrrhetinic Acid Against the Cardiotoxicity of Aconitine Based on Mitochondrial
        Energy Metabolism
        HE Miao1，2， LI Yaowei1， WANG Zhiqi2，3*， ZHOU Zhihua1， PU Keting3， CONG Mengjing3， WANG Jiaxing3
        （1. Graduate School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Research Center of Standardization and Functional Engineering of Traditional Chinese Medicine in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）
        〔Abstract〕 Objective To explore the antagonistic effect of glycyrrhetinic acid on cardiomyocytes cytotoxicity of aconitine from the perspective of mitochondrial energy metabolism. Methods The H9c2 cells of rat cardiomyocytes were randomly divided into 10 groups： blank group， glycyrrhetinic acid group， 4 aconitine groups （aconitine 120， 2
reactive oxygen species是什么意思40， 480， 960 μmol/L）， and 4 aconitine combined with glycyrrhetinic acid groups （aconitine in different concentrations was compatible with 60 μmol/L glycyrrhetinic acid）. The effect of different concentrations on the H9c2 cell was determine by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）. The content of adenosine5’-triphosphate （ATP） and the level of ATP enzyme activity in each group were measured by ELISA. The intracellular reactive oxygen species （ROS） was detected by 2，7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate （DCFH-DA）， 5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide （JC-1） was used to detect intracellular mitochondrial membrane potential and rhod-2 acetoxymethyl ester （Rhod-2AM） probe was used to detect intracellular calcium ion concentration. Results Compared with aconitine alone， the ATP content， Ca2+-ATPase， Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase activities of cardiomyocytes were significantly increased after aconitine combined with glycyrrhetinic acid. The ROS content， mitochondrial membrane potential and intracellular calcium concentration were significantly decreased （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Glycyrrhetinic acid can reduce the cardiotoxicity of aconitine， which may be related to the protection of mitochondria of c
ardiomyocytes， the enhancement of mitochondrial energy metabolism and the maintenance of calcium homeostasis.
        〔Keywords〕 mitochondrial energy metabolism; aconitine; glycyrrhetinic acid; cardiotoxicity; calcium homeostasis
        附子为典型的毒效共存中药，配伍是降低其毒性常用的方法之一[1-2]。在“中药方剂数据库”网站检索发现：约有96%含乌头类药材（附子或川乌、草乌）方剂中同时含甘草[3]。课题组前期研究[4-6]表明，附子单煎液对离体心衰蛙心及大鼠心脏都有强心作用;与甘草配伍后，其强心作用较附子单煎液弱;和甘草次酸Tmax均推迟，Cmax均降低，吸收均受到抑制，t1/2均缩短[7]。
        一般认为，附子的主要毒性成分是乌头类生物碱，其中毒性较强是，主要影响心血管、神经等系统[8]，心脏是其毒性作用的主要靶器官[9]，大剂量时会诱发心律失常。研究还发现，的心肌毒性可表现为影响心肌细胞能量代谢，配伍甘草次酸后可有效拮抗引发的心律失常[10]。线粒体是心肌细胞中主要负责能量代谢的细胞器，膜电位、三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate， ATP）、Ca2+浓度等是表征相关功能的经典指标[11]，
且其正常的能量代谢功能与细胞内钙稳态密切相关[12]。当心脏组织受到损伤时，心肌细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）释放增多、Ca2+浓度失衡、能量代谢紊亂[13]。
        故本研究以心肌细胞线粒体能量代谢为切入点，以ATP含量、线粒体膜电位、ROS浓度、线粒体Ca2+浓度、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性为指标，在细胞水平对甘草次酸拮抗心肌毒性作用进行研究。
        1 材料
        1.1 实验细胞系
        大鼠心肌细胞（H9c2）购自普诺赛生物公司，货号：CL-0089。将H9c2细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养基、5% CO2、37 ℃条件下进行培养，待细胞密度达90%左右后0.25%胰酶消化传代，平均2～3 d一代，取对数生长期细胞进行实验。
        1.2 实验药物
        （aconitine， AC）储备液：将20 mg溶于150 μL DMSO中，而后将含的DMSO溶解于31 mL空白DMEM培养基中，涡旋混匀，使之成为1 mmol/L的储备液，以0.22 μm针头式一次性过滤器除菌后分装于15 mL的离心管中，-20 ℃条件下保存备用。
        甘草次酸（alycyrrhizic acid， GA）储备液：将20 mg甘草次酸溶于200 μL DMSO中，而后将含甘草次酸的DMSO溶解于21 mL空白DMEM培养基中，涡旋混匀，使之成为2 mmol/L的甘草次酸储备液，以0.22 μm针头式一次性过滤器除菌后分装于15 mL的离心管中，-20 ℃条件下保存备用。
        噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）储备液：将250 mg MTT溶解于50 mL PBS中，涡旋混匀，使之成为5 mg/mL的MTT储备液，以0.22 μm针头式一次性过滤器除菌后分装于15 mL的离心管中，-20 ℃条件下保存备用。
        1.3 主要试剂与仪器
        特级胎牛血清（批号：124210-500）、DMEM高糖培养基（批号：PM150210）、PB
S缓冲液（批号：PB180327）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批号：PB180226）、无血清非程序冻存液（批号：PB180438 ）、D-Hanks液（批号：PB180321）均购于普诺赛生命科技有限公司;噻唑蓝（MTT）（批号：M8180）、二甲基亚砜（DMSO）（培养级，批号：D8371）、线粒体膜电位试剂盒（批号：M8650）、青链霉素混合液（批号：P1400）均购于索莱宝生物科技有限公司;Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（批号：M120702）购于上海源培生物科技股份有限公司;二甲基亚砜（DMSO）（分析级，批号：D806645）、对照品（批号：DST200729-006，纯度≥98%）、甘草次酸对照品（批号：DST200619-007，纯度≥98%）均购于德斯特生物技术有限公司;ATP含量测定试剂盒（批号：A095-2-1）、Ca2+-ATP酶试剂盒（批号：A070-4-1）、Na+-K+-ATP酶试剂盒（批号：A070-2-2）、Ca2+-Mg2+-ATP酶试剂盒（批号：A070-3-2）、ROS测定试剂盒（批号：E004-1-1）均购于南京建成生物科技研究所;Rhod-2 AM钙荧光探针（批号：21060）购于美国AAT BIOQUES公司。

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