香烟烟雾提取物对巨噬细胞线粒体功能的影响
魏金淑，田　园，于晓雅，管美琪，蔚京京△
（山西医科大学儿科医学系，太原０３０００１）
【摘要】　目的：研究香烟烟雾提取物（ＣＳＥ）对巨噬细胞线粒体功能的影响。方法：本研究选取ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞进行实验。当细胞融合度达７０％左右，弃旧培养液，将１００％ＣＳＥ原液用无血清的ＤＭＥＭ和ＦＢＳ稀释成１％、５％、１５％、２５％和９０％ＣＳＥ加入到孔板中，采用ＣＣＫ ８法检测不同浓度ＣＳＥ处理ＲＡＷ２６４．７细胞２４ｈ的细胞活性；再选取最佳ＣＳＥ浓度分别处理细胞０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ，ＣＣＫ ８法检测ＣＳＥ处理细胞不同时间组细胞活性。
０％、５％和２５％ＣＳＥ处理２４ｈ后，ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ染检测细胞坏死和凋亡情况；ＪＣ １线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞线粒体膜受损情况；ＲＯＳ特异性染料ＤＣＦＨ ＤＡ对小鼠巨噬细胞进行染后，流式细胞计数法测定荧光度及ＲＯＳ阳性巨噬细胞数目比例；增强型ＡＴＰ检测试剂盒检测细胞内ＡＴＰ浓度。结果：①和０％ＣＳＥ组比较，１％ＣＳＥ处理组细胞活性显著增加（Ｐ＜０．０１），当ＣＳＥ浓度为５％以上时细胞活性显著下降（Ｐ＜０．０５）；使用５％ＣＳＥ处理巨噬细胞，随着处理时间的增加细胞活性显著下降（Ｐ＜０．０１）。②和０％ＣＳＥ组比较，５％ＣＳＥ和２５％ＣＳＥ处理主要导致巨噬细胞坏死，引起巨噬细胞线粒体膜电位显著下降、Ｒ
ＯＳ生成显著增加（Ｐ＜０．０１）、ＡＴＰ浓度显著减少（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），且２５％ＣＳＥ处理组的变化更为显著（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。结论：ＣＳＥ处理可能影响巨噬细胞线粒体功能，进而导致细胞活性下降并出现坏死。
【关键词】　香烟烟雾；巨噬细胞；线粒体功能；细胞坏死
【中图分类号】Ｒ３９２    【文献标识码】Ａ    　【文章编号】１０００ ６８３４（２０２２）０６ ６２８ ００５
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．６３７０．２０２２．１１４ 
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｔｒａｃｔｏｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ
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【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｔｒａｃｔ（ＣＳＥ）ｏｎｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＲＡＷ２６４．７ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ｗｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙｗａｓａｂｏｕｔ７０％，ｔｈｅｏｌｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗａｓａｂａｎｄｏｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅ１００％ＣＳＥｓｔｏｃｋｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓｄｉｌｕｔｅｄｗｉｔｈｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅＤＭＥＭａｎｄＦＢＳｉｎｔｏ１％，５％，１５％，２５％ａｎｄ９０％ＣＳＥａｎｄａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｗｅｌｌｐｌａｔｅ．ＴｈｅｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＣＳＥａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｏｒ２４ｈｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＣＣＫ ８ｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｎｔｈｅｏｐｔｉｍａｌＣＳＥｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｔｒｅａｔｃｅｌｌｓｆｏｒ０ｈ，２４ｈ，４８ｈｏｒ７２ｈｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｌｙ，ａｎｄＣＣＫ ８ａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＳＥｔｒｅａｔｅｄｃｅｌｌｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｇｒｏｕｐｓ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ０％，５％ａｎｄ２５％ＣＳＥｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ，ｃｅｌｌｎｅｃｒｏｓｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩｓｔａｉｎｉｎｇ；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍ ｂｒａｎｅｄａｍａｇｅｏｆＲＡＷ２６４．７ｗａｓｄｅ
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ｏｕｐ（Ｐ＜０．０５ｏｒＰ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＣＳＥｍａｙａｆｆｅｃｔｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｌｅａｄｉｎｇｔｏｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｎｄｎｅｃｒｏｓｉｓ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】　ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ；　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ；　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ；　ｎｅｃｒｏｓｉｓ
  【基金项目】山西省科技厅自然科学研究面上项目基金资助（２０２２０３０２１２１１２４２）
【收稿日期】２０２２ １０ １８【修回日期】２０２２ １１ ２５
　△【通讯作者】Ｔｅｌ：１３９３４２２８７４６；Ｅ ｍａｉｌ：ｗｅｉｊｊ８２＠１２６．ｃｏｍ  吸烟是世界范围内第二致死原因和第四致病危险因素，每年约６００万人因吸烟而死亡，其中超过５００万人死于一手烟，超过６０万人死于二手烟［１］。中国有３．５亿人吸烟和近７．４亿非吸烟者被动接触
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二手烟，其中有１．８亿１５岁以下儿童暴露于二手烟［２］。香烟烟雾（ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ，ＣＳ）中含有６０００多种分子及有毒化合物，对人体的危害不容忽视，可导致吸烟者呼吸系统的慢性炎症、气道阻塞、肺组织破坏和肺气肿等，儿童更易罹患呼吸道感染、哮喘等疾病［３ ５］。
巨噬细胞广泛分布于机体各组织，是人体内重要的吞噬细胞和免疫细胞，在宿主防御、组织修复和维持肺稳态中发挥着关键作用。正常情况下，肺组织中的巨噬细胞可通过吞噬清除吸入的颗粒、病原体和细胞碎片等维持呼吸系统的正常功能和免疫稳态。但巨噬细胞在吞噬有毒颗粒、药物、污染物或病原体等物质启动免疫系统对机体提供保护的同时，也可能导致肺损伤和致病性免疫反应的发生。如上述有毒有害物质的刺激过强，巨噬细胞的表型或功能就会出现失衡，从而影响肺稳态出现疾病［６］。研究表明，巨噬细胞暴露于香烟烟雾可产生大量活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）导致气道炎症和氧化应激［７］。线粒体是细胞进行有氧呼吸的细胞器，提供细胞生命活动所需的能量，然而膜结构破坏、呼吸链复合体受损、酶活性降低、线粒体ＤＮＡ突变等因素均可导致线粒体功能障碍。香烟烟雾可使线粒体生成大量的ＲＯＳ并导致氧化应激和线粒体ＤＮＡ损伤，进而导致线粒体蛋白质合成和呼吸功能受损，为应对上述损伤，受损线粒体发生自噬，同时其生物合成被激活［８］。但香烟烟雾对巨噬细胞线粒体功能的影响及机制研究较少。因此本研究通过制备香烟烟雾提取物（ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｔｒａｃｔ，ＣＳＥ），观察并探索不同浓度ＣＳＥ处理不同
时间后对巨噬细胞线粒体功能的影响及其机制，为寻新的靶点防治香烟烟雾暴露导致的危害和疾病提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　ＣＳＥ的制备
ＣＳＥ的制备是参考Ｓｈｅｒｉｄａｎ的方法并加以改进［９］。燃烧４支去除过滤嘴的香烟（猴王牌，中国陕西宝鸡卷烟厂，焦油含量１１ｍｇ／支），并通过真空抽吸泵将大部分香烟烟雾吸入装有２０ｍｌ无血清ＤＭＥＭ培养基的瓶中。为了让香烟充分燃烧，每支香烟的燃烧时间控制在５ｍｉｎ左右。通过剧烈摇晃瓶身将香烟烟雾溶解到细胞培养基中，最终得到颜为咖啡样的液体。紫外分光光度计（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈ ｅｒ，美国）检测ＣＳＥ的ＯＤ值，尽量保持每次制备ＣＳＥ的ＯＤ值恒定（２．００±０．０５）。用ＮａＯＨ溶液将ＣＳＥ的ｐＨ值调节到７．３ ７．４，然后使用０．４５μＭ和０．２２μｍｏｌ／Ｌ的过滤器过滤除菌，最终得到１００％ＣＳＥ原液并储存在４°Ｃ备用。
１．２　细胞培养及处理
根据实验需要，将ＲＡＷ２６４．７细胞分批接种于培养皿或培养板中，加入含ＤＭＥＭ高糖、１０％胎牛血清（ＦＢＳ）和１％青链霉素的ＲＡＷ２６４．７细胞专用培养基（均购自武汉普诺赛），置于３７℃含有５％ＣＯ
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的细胞培养箱中培养。每两天更换一次细胞培养液，并在倒置显微镜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，美国）下观察细胞生长状态。当细胞达到指数生长期，进行传代（１∶３～４）和铺板。
当培养板中细胞融合度达７０％左右，弃旧培养液，将１００％ＣＳＥ原液用无血清的ＤＭＥＭ和ＦＢＳ稀释成含不同浓度ＣＳＥ（０％、１％、５％、１５％、２５％和９０％）的培养液加入到相应的孔中，其中０％ＣＳＥ为对照组，其他浓度的ＣＳＥ为处理组，然后将细胞放入培养箱中，２４ｈ后检测细胞活性确定ＣＳＥ最佳处理浓度。细胞铺板培养，按不同处理时间（２４、４８、７２ｈ）分组，分别于预定检测时间前２４、４８、７２ｈ使用最佳浓度的ＣＳＥ处理细胞，然后检测细胞活性。在此基础上，选择５％ＣＳＥ和较大的处理浓度２５％ＣＳＥ，观察其对细胞凋亡坏死情况、线粒体膜电位及ＡＴＰ等指标的影响。
１．３　细胞活性检测
采用ＣＣＫ ８法（北京赛文）检测不同处理条件时ＲＡＷ２６４．７的细胞活力。将对数生长期细胞接种于９６孔板中，１０００～１００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，１００μｌ培养基／孔，不同干预刺激处理后，加入１０μｌＣＣＫ ８孵育１ｈ。最后，通过酶标仪（ＳｙｎｅｒｇｙＨ１，美国）在４５０ｎｍ处测量ＯＤ值。细胞活力％＝（处理组ＯＤ 空白ＯＤ）／（对照组ＯＤ 空白ＯＤ）×１００％；
其中处理组为ＣＳＥ处理的细胞组；空白为不加细胞只加完全培养液的组；对照组为不加ＣＳＥ处理的细胞组。１．４　ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ染观察细胞坏死的情况
根据ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ试剂盒（大连美伦）的说明书，将处于对数生长期的细胞接种于９６孔板中，使用５％和２５％ＣＳＥ分别处理细胞２４ｈ后，加入预冷ＰＢＳ溶液洗２次。在细胞沉淀中加入１×Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ工作液，加５μｌＰＩ和５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ，轻轻混匀，室温避光孵育１５ｍｉｎ。然后在荧光显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本）下观察细胞，红荧光表示坏死细胞，绿荧光表示凋亡细胞。
１．５　线粒体相关指标的检测
１．５．１　巨噬细胞内ＲＯＳ检测　在规定时间内处理
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细胞后，根据ＲＯＳ测定试剂盒（南京建成）的说明，弃旧培养基，加入２００μｌ１０μｍｏｌ／ＬＤＣＦＨ ＤＡ工作液，液体完全覆盖细胞，３７℃避光孵育２０ｍｉｎ，通过流式细胞仪（ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏⅡ，美国）检测巨噬细胞内ＲＯＳ的水平。
１．５．２　线粒体膜电位检测　线粒体膜损伤可导致膜电位变化。将细胞接种在２４孔板中，根据ＪＣ １线粒体膜电位测定试剂盒（大连美伦）说明，加入ＪＣ １荧光染料（２μｇ／ｍｌ）后在培养箱中孵育１５ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗两次后，在荧光显微镜下观察细胞。绿荧光表示线粒体膜电位去极化和线粒体受损，存在于凋亡或坏死细胞中；红荧光表示正常细胞。１．５．３　巨噬细胞内ＡＴＰ浓度的检测　细胞接种于２４孔板，处理完成后弃上清，根据ＡＴＰ检测试剂盒（上海碧云天）的说明加入ＡＴＰ裂解液（５０μｌ／ｗｅｌｌ）裂解，４℃１１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后取上清。使用不透光的９６孔板中加入１００μｌＡＴＰ检测工作液后，加入２０μｌ标准品和样本，用多功能酶标仪测定ＲＬＵ值，最后绘制标准曲线并计算样本ＡＴＰ浓度。１．６　统计学处理
实验数据以均值±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，采用Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ９．０软件进行统计分析。数据类型为计量资料，均符合正态分布且方差齐性，三组及三组以上数据比较采用单因素方差分析（ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ），组间进行两两比较时采用ＬＤＳ ｔ检验。
２　结果
２．１　ＣＳＥ对巨噬细胞活性的影响
首先检测不同浓度的ＣＳＥ处理组细胞活性。１％ＣＳＥ组细胞活性为（１４４．７９±２３．２６）％与０％ＣＳＥ组（１００．００±１０．７８）％相比，细胞活性显著增加（Ｐ＜０．０１）；５％ＣＳＥ组细胞活性为（８７．１２±２．９２）％与０％ＣＳＥ组相比，细胞活性显著降低（Ｐ＜０．０５）；１５％ＣＳＥ、２５％ＣＳＥ、９０％ＣＳＥ组细胞活性分别为（２７．７０±４．２７）％、（３４．８４±２．６４）％、（２３．５９±４．３１）％与０％ＣＳＥ组相比，细胞活性显著降低（Ｐ＜０．０１）。因此，当ＣＳＥ浓度为５％以上时，细胞活性开始显著下降（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；接下来选取使细胞活性降低的临界浓度５％ＣＳＥ处理细胞，检测不同处理时间组如０ｈ、２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ组的细胞活性。
５％ＣＳＥ处理细胞２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ组细胞活性分别为（６７．２６±４．１１）％、（４４．１０±２．６２）％、（２４．２４±１．４５）％，与０ｈ组（１００．００±１６．９８）％相比细胞活性显著下降（Ｐ＜０．０１）；因此，随着５％ＣＳＥ对细胞处理时间的增加，细胞活性越低（Ｐ＜０．０１）。
２．２　ＣＳＥ对巨噬细胞坏死和凋亡的影响
ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ染后，用荧光显微镜观察不同浓度组的ＣＳＥ引起巨噬细胞坏死和凋亡情况，红荧光表示坏死细胞，绿荧光表示凋亡细胞。如图１所示，和０％ＣＳＥ组比较，５％ＣＳＥ和２５％ＣＳＥ处理组坏死细胞数量均增多，凋亡细胞数量均减少；且２５％ＣＳＥ
组的变化更为明显。
Ｆｉｇ．１　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＣＳＥｏｎｃｅｌｌｎｅｃｒｏｓｉｓ（×１００）
２．３　ＣＳＥ对巨噬细胞线粒体膜电位的影响
使用ＪＣ １探针对巨噬细胞染并于荧光显微镜下观察线粒体膜电位的变化。如图２所示，当线粒体膜电位下降时，ＪＣ １不能聚集在线粒体中，以单体（Ｊ ｍｏｎｏｍｅｒ）形式弥散在整个细胞中，产生绿荧光；当线粒体膜电位较高时，ＪＣ １以聚合物（Ｊ ａｇ ｇｒｅｇａｔｅｓ）的形式存在于细胞中，产生红荧光。与０％ＣＳＥ组比较，５％ＣＳＥ处理组红荧光减少，绿荧光增多；２５％ＣＳＥ处理组红荧光几乎消失，绿荧光明显增多。提示ＣＳＥ可引起线粒体膜电位下降，
线粒体膜损伤。
Ｆｉｇ．２　ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＣＳＥｏｎｍｉｔｏｃｈｏｎ ｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ（×２００）reactive oxygen species是什么意思
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２．４　ＣＳＥ对巨噬细胞内ＡＴＰ浓度的影响
如表１所示，与０％ＣＳＥ组比较，５％ＣＳＥ和２５％ＣＳＥ处理组细胞内ＡＴＰ浓度显著降低（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），且与５％ＣＳＥ组比较，２５％ＣＳＥ处理组ＡＴＰ浓度显著降低（Ｐ＜０．０１）。提示ＣＳＥ影响细胞内ＡＴＰ的生成。
２．５　ＣＳＥ对巨噬细胞ＲＯＳ的影响
通过流式细胞计数法检测ＲＯＳ阳性的巨噬细胞数目比例及荧光强度。图３中Ｍ２ １表示的是正常的没有与ＤＣＦＨ ＤＡ染料结合的ＲＯＳ阴性细胞峰，下方的数字如８９．５８％表示的是ＲＯＳ阴性细胞比例；Ｍ２ ２表示的是与ＤＣＦＨ ＤＡ染料结合的ＲＯＳ阳性细胞峰，下方的数字如１０．３６％表示的是ＲＯＳ阳性细胞比例。横坐标的１０１，１０２表示的是ＦＩＴＣ的荧光强度。如图３和表１所示，与０％ＣＳＥ组比较，５％ＣＳＥ和２５％ＣＳＥ处理组ＲＯＳ阳性细胞数目比例和荧光强度均显著增加（Ｐ＜０．０１）。与５％ＣＳＥ组比较，２５％ＣＳＥ组ＲＯＳ阳性巨噬细胞数目和荧光强度均有增加趋势，但差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）
。
Ｆｉｇ．３　ＦｌｏｗｃｈａｒｔｏｆＲＯＳｃｏｎｔｅｎｔｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
Ｔａｂ．１　ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＣＳＥｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＡＴＰａｎｄＲＯＳ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ｇｒｏｕｐ　０％ＣＳＥ　５％ＣＳＥ　２５％ＣＳＥ
ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡＴＰｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎｍｏｌ／Ｌ）  ７２．６１±５．４５  ４２．７３±１．９６  　１９．６６±２．８７  ＃
ＭｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆＲＯＳ１８２５１７．６７±６９９９３．４１９５７３７４．３３±３１１５５．６５  １７２４４６２．３３±６６０７０６．５４  ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔｏｆＲＯＳ＋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ（％）  １０．４０±３．２５  ２９．５５±２．０５    ４１．４１±７．９３
  ＣＳＥ：Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｔｒａｃｔ；ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ；ＡＴＰ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
  Ｐ＜０．０５，  Ｐ＜０．０１ｖｓ０％ＣＳＥ；＃Ｐ＜０．０５ｖｓ５％ＣＳＥ
３　讨论
香烟烟雾暴露是引起呼吸系统疾病的重要因素，但具体机制尚未阐明。近年来线粒体功能障碍及其在疾病中的作用越来越受到重视。线粒体不但能生成ＡＴＰ为细胞提供能量，还承担许多重要的生理功能，如细胞增殖与代谢的调控、钙离子储存、合成胆固醇及某些血红素、调节膜电位并控制细胞程序性死亡等等［１０］。线粒体对环境毒物、烟草烟雾和空气污染物的各个有害成分高度敏感，长期暴露于这些成分或各种应激均可导致线粒体功能障碍，影响机体正常生理功能。本研究发现，ＣＳＥ处理可导致巨噬细胞活性降低甚至坏死，细胞内ＡＴＰ含量下降，ＲＯＳ产生增多，线粒体膜电位下降，可能与其导致线粒体功能障碍有关。
不同研究报道，引起细胞活性下降的ＣＳＥ临界浓度不一致。有研究报道，０．５％ＣＳＥ处理细胞后细胞活性下降［１１］；也有研究报道，１０％ＣＳＥ引起细胞活性下降［１２］。本研究结果表明，１％ＣＳＥ使细胞活性增加，当其浓度为５％以上时，细胞活性降低。这可能是由于ＣＳＥ制备的方法及实验选取的细胞系不同造成的差异。细胞活性的降低可能与线粒体功能受损有关［１３］。正常情况下，线粒体合成ＡＴＰ会产生少量ＲＯＳ，机体通过抗氧化系统清除ＲＯＳ以维持氧化还原平衡。当线粒体长期暴露于毒物、烟草烟雾和空气污染环境中，线粒体膜电位转换孔异常开放，增加线粒体膜的通透性并诱发线粒体膜电位降低，导致线粒体功能受损［１４］。线粒体功能受损可减少ＡＴＰ的合成，产生大量ＲＯＳ并超过机体的代偿范围，进一步攻击线粒体，形成恶性循环［１３］。
坏死是细胞遭受化学、物理因素或严重的病理性刺激引起的细胞被动死亡方式；凋亡是生理因素或轻微
病理刺激引起的细胞程序性死亡方式［１５］。本研究结果提示，ＣＳＥ主要引起细胞坏死，这可能是因为ＣＳＥ对细胞是一种较强的化学刺激，细胞以坏死的形式发生死亡。而线粒体功能在调控细胞程序性死亡中发挥着重要作用，线粒体功能障碍引起的ＡＴＰ减少和ＲＯＳ生成增多都是细胞坏死的驱动力［１６，１７］。因此，本研究中ＣＳＥ处理后巨噬细胞发生坏死可能与线粒体功能受损有关。但是，ＣＳＥ能否引起巨噬细胞发生其他形式的死亡尚不清楚，对此有待进一步研究。
既往研究多聚焦于ＣＳＥ对巨噬细胞极化、炎症、氧化应激这三方面［１８ ２０］，也发现ＣＳＥ可引起巨噬细胞ＲＯＳ增多，但对ＣＳＥ和线粒体之间的研究仅局限于线粒体形态及融合／裂变的机制，有关ＣＳＥ对巨噬细胞线粒体功能的影响报道较少。本研究结果表明，ＣＳＥ可导致巨噬细胞线粒体膜电位下降并
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影响线粒体功能，对于阐述香烟烟雾引起巨噬细胞损伤的机制有一定的意义。
综上所述，ＣＳＥ引起巨噬细胞活性降低甚至坏死，细胞内ＲＯＳ生成增多而ＡＴＰ浓度减少，可能与线粒体膜电位下降及线粒体功能受损有关。但是ＣＳＥ是否通过影响线粒体功能调节细胞死亡方式及其机制还需进一步探索。减少香烟烟雾对巨噬细胞线粒体功能的影响，并恢复线粒体功能可能是未来与香烟烟雾暴露相关性疾病的靶点之一。
【参考文献】
［１］　ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ［ＥＢ／ＯＬ］．［２０２２ ０９ １２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｎ／ｎｅｗｓ ｒｏｏｍ／ｆａｃｔ
ｓｈｅｅｔｓ／ｄｅｔａｉｌ／ｔｏｂａｃｃｏ．
［２］　刘　娜，周灵妮，杨功焕，等．中国人２００２年吸烟和被动吸烟的现状调查［Ｊ］．中华流行病学杂志，
２００５（２）：５ １１．
［３］　ＴａｎｓｋｉＳＥ，ＷｉｌｓｏｎＫＭ．Ｃｈｉｌｄｒｅｎａｎｄｓｅｃｏｎｄｈａｎｄｓｍｏｋｅ：ｃｌｅａｒｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，２０１２，１２９（１）：
１７０ １７１．
［４］　ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＳＯ，ＣｕｎｈａＣ，ＳｏａｒｅｓＧ，ｅｔａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｃｕｒｒｅｎｔｌｙｐｒｏｐｏｓｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｏｆ
ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ），２０２１，１４（１０）：９７９．
［５］　ＰａｐｐａｓＲＳ．Ｔｏｘｉｃｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｏｂａｃｃｏａｎｄｉｎｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ：ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｅｔａｌｌｏｍｉｃｓ，２０１１，３
（１１）：１１８１ １１９８．
［６］　ＭｕｒｒａｙＰＪ，ＡｌｌｅｎＪＥ，ＢｉｓｗａｓＳＫ，ｅｔａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃ ｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１４，４１（１）：１４ ２０．［７］　ＺｈａｎｇＭＹ，ＪｉａｎｇＹＸ，ＹａｎｇＹＣ，ｅｔａｌ．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｄｕｃｅｓｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｂｒｏｎｃｈｉａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＲＯＳ／ＮＬＲＰ３／ｃａｓｐａｓｅ １ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．
ＬｉｆｅＳｃｉ，２０２１，２６９：１１９０９０．
［８］　ＢｏｃｋＦＪ，ＴａｉｔＳ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａａｓｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０２０，２１（２）：
８５ １００．
［９］　ＳｈｅｒｉｄａｎＪＡ，ＺａｇｏＭ，ＮａｉｒＰ，ｅｔａｌ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎｏｆｔｈｅＮＦ ｋａｐｐａＢｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＲｅｌＢｉｎｌｕｎｇｆｉｂ
ｒｏ
ｂｌａｓｔｓｆｒｏｍｓｍｏｋｅｒｓｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔＣＯＰＤｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ
ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ ｉｎｄｕｃｅｄＣＯＸ ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｒｅｓｐｉｒ
Ｒｅｓ，２０１５，１６：５４．
［１０］ＰｒａｋａｓｈＹＳ，ＰａｂｅｌｉｃｋＣＭ，ＳｉｅｃｋＧＣ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｉｒｗａｙｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｓｔ，２０１７，１５２
（３）：６１８ ６２６．
［１１］ＦｅｎｇＨ，ＹｉｎＹ，ＲｅｎＹ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆＣＳＥｏｎＭ１／Ｍ２ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉｎａｌｖｅｏｌａｒａｎｄｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｔｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｎｄｅｘｐｏｓｕｒｅｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＩｎＶｉｔｒｏ
ＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌＡｎｉｍ，２０２０，５６（２）：１５４ １６４．
［１２］ＨｏｎｇＪ，ＣｈｅｎＱ，ＷａｎｇＹ，ｅｔａｌ．Ｄｅｘｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅａｌｌｅ ｖｉａｔｅｓｓｍｏｋｅ ｉｎｄｕｃｅｄｂｒｏｎｃｈｉａｌａｎｄａｌｖｅｏｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．ＧｅｎＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｐｈｙｓ，２０２０，３９（３）：
２９３ ３００．
［１３］ＧｅｏｒｇｉｅｖａＥ，ＩｖａｎｏｖａＤ，ＺｈｅｌｅｖＺ，ｅｔａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｄｏｘｉｍｂａｌａｎｃｅａｓａｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍａｒｋｅｒｏｆ
“ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅｓ＂［Ｊ］．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ，２０１７，３７
（１０）：５３７３ ５３８１．
［１４］ＹａｎｇＨ，ＺｈａｎｇＺ．Ｓｅｐｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｄｙｓｆｕｎｃ ｔｉｏｎ：ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｆｌａｍｍ
Ｒｅｓ，２０２１，７０（４）：３７９ ３８７．
［１５］Ｄ＇ＡｒｃｙＭＳ．Ｃｅｌｌｄｅａｔｈ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｆｏｒｍｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｃｒｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔ，
２０１９，４３（６）：５８２ ５９２．
［１６］ＺｈａｎｇＹ，ＳｕＳＳ，ＺｈａｏＳ，ｅｔａｌ．ＲＩＰ１ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａ ｔｉｏｎｉｓｐｒｏｍｏｔｅｄｂｙｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＲＯＳａｎｄｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒ
ＲＩＰ３ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｉｎｔｏｎｅｃｒｏｓｏｍｅ［Ｊ］．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ，
２０１７，８：１４３２９．
［１７］ＬｅｉｓｔＭ，ＳｉｎｇｌｅＢ，ＣａｓｔｏｌｄｉＡＦ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａ ｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ａｓｗｉｔｃｈｉｎ
ｔｈｅｄｅｃｉｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｎｅｃｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＪＥｘｐ
Ｍｅｄ，１９９７，１８５（８）：１４８１ １４８６．
［１８］ＹｕａｎＦ，ＦｕＸ，ＳｈｉＨ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｍａｃｒｏ ｐｈａｇｅＭ２ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｂｙｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｔｒａｃｔｖｉａｔｈｅ
ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１４，９（９）：
ｅ１０７０６３．
［１９］ＢａｌｌｗｅｇＫ，ＭｕｔｚｅＫ，ＫｏｎｉｇｓｈｏｆｆＭ，ｅｔａｌ．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｔｒａｃｔａｆｆｅｃｔｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｌｖｅｏｌａｒ
ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＬｕｎｇＣｅｌｌＭｏｌＰｈｙｓｉｏｌ，
２０１４，３０７（１１）：Ｌ８９５ Ｌ９０７．
［２０］张　明，张　莉，杨　侠，等．Ｎ 乙酰半胱氨酸对香烟烟雾提取物诱导的气道上皮细胞线粒体过氧化损
伤的保护作用［Ｊ］．西安交通大学学报（医学版），
２０２１，４２（６）：８３７ ８４２．
２
３
６ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２２，３８（６）
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