［文章编号］㊀１６７４⁃８６０３（２０２０）０４⁃０２２７⁃０５
ＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１信号通路调控口腔鳞状细胞癌肿瘤浸润
Ｔ淋巴细胞分化的机制
谢文强，卢涣滋，林冬佳，杨利洒，王智∗
（中山大学附属口腔医院㊃中山大学光华口腔医学院，广东省口腔医学重点实验室，广东广州５１００５５）
［摘要］㊀目的：探究口腔鳞状细胞癌（ＯＳＣＣ）肿瘤微环境中活性氧（ＲＯＳ）对肿瘤浸润Ｔ淋巴细胞分化的作用㊂方法：流式细胞术分析ＯＳＣＣ肿瘤组织和远端正常组织Ｔ淋巴细胞各分化亚比例，ＲＯＳ试剂盒检测Ｔ淋巴细胞各分化亚ＲＯＳ表达情况，实时荧光定量ＲＴ⁃ＰＣＲ检测癌及远端正常组织中低氧诱导因子１Ａ（ＨＩＦ１Ａ）㊁葡萄糖转运蛋白１（ＧＬＵＴ１）㊁己糖激酶２（ＨＫ２）等Ｔ淋巴细胞代谢相关基因，利用ＧＥＰＩＡ２数据库分析Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ在肿瘤及远端正常组织的差异表达及其与预后的相关性㊂结果：与正常组织相比，效应Ｔ淋巴细胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－）在癌组织中所占比例较高（Ｐ＜０．０５）；癌组织中ＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞的ＲＯＳ含量高于正常组织（Ｐ＜０．０５），癌组织中效应Ｔ淋巴细胞的ＲＯＳ含量高于效应记忆性Ｔ淋巴细胞（Ｐ＜０．０５），正常组织
中效应Ｔ淋巴细胞和效应记忆性Ｔ淋巴细胞中ＲＯＳ含量未见统计学差异（Ｐ＞０．０５）；癌组织中Ｔ淋巴细胞ＨＩＦ１Ａ㊁ＧＬＵＴ１㊁ＨＫ２表达高于正常组织Ｔ淋巴细胞（Ｐ＜０．０５）；Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ水平在肿瘤组织中比较高，但未见统计学差异（Ｐ＞０．０５），肿瘤组织中效应Ｔ细胞的ＨＩＦ１Ａ水平明显高于远端正常组织，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；Ｔ细胞高表达ＨＩＦ１Ａ的肿瘤相对预后较好（Ｐ＜０．０５）㊂结论：ＯＳＣＣ肿瘤微环境中ＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１信号通路上调与肿瘤组织中高比例的效应Ｔ淋巴细胞存在高度相关性㊂
［关键词］㊀口腔鳞状细胞癌；Ｔ淋巴细胞；糖酵解；活性氧；低氧诱导因子１
［中图分类号］㊀Ｒ７３９．８㊀㊀［文献标识码］㊀Ａ㊀㊀［ｄｏｉ］㊀１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４⁃８６０３．２０２０．０４．００４ＴｈｅＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎＯＳＣＣ
ＸＩＥＷｅｎｑｉａｎｇ，ＬＵＨｕａｎｚｉ，ＬＩＮＤｏｎｇｊｉａ，ＹＡＮＧＬｉｓａ，ＷＡＮＧＺｈｉ．（ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｈｕａＳｃｈｏｏｌｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＳｕｎＹａｔ⁃ｓｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００５
５，Ｃｈｉｎａ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧＺｈｉ，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｚｈ７５＠ｓｙｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ｏｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＴｌｙｍｐｈｏ⁃
ｃｙｔｅｓｉｎｏｒａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＯＳＣＣ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎｔｕｍｏｒａｎｄｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＲＯＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈＲＯＳｋｉｔ．ＧｅｎｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＴｃｅｌｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＨＩＦ１Ａ，
ＧＬＵＴ１，ＨＫ２）ｉｎｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅａｌｔｉｍｅＲＴ⁃ＰＣＲ．ＧＥＰＩＡ２ｄａｔａｂａｓｅｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌＨＩＦ１ＡｉｎｔｕｍｏｒａｎｄｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓｖａｌｕｅｏｆｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＴｃｅｌｌＨＩＦ１Ａｉｎｐａ⁃ｔｉｅｎｔｓ．Ｒｅ
ｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｅｆｆｅｃｔｏｒｓＴｃｅｌｌｓ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－）ｉｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｄｉｓｔａｌｎｏｒ⁃
ｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＲＯＳｉｎＣＤ３＋Ｔｃｅｌｌｓｉｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜
０．０５），ａｎｄｉｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ，ｔｈｅＲＯＳｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｉｎｅｆｆｅｃｔｏｒＴｃｅｌｌｓｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｉｔｓｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｉｎ
ｅｆｆｅｃｔｏｒｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆＲＯＳｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒＴｃｅｌｌａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｒｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌｉｎｔｈｅｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅ（Ｐ＞０．０５）．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＨＩＦ１Ａ，ＧＬＵＴ１，ＨＫ２ｉｎｔｕｍｏｒ⁃ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＴｃｅｌｌｓｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｉｎ
ｔｈｏｓｅｉｎｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｃｅｌｌＨＩＦ１Ａ
ｌｅｖｅｌｗａｓｈｉｇｈｅｒｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓｔｈａｎｔｈａｔｉｎｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ，ｂｕｔｎｏｓｉｇ⁃ｎｉｆｉｃａｎｔｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｆｏｕｎｄ．ＴｈｅＨＩＦ１ＡｌｅｖｅｌｏｆｅｆｆｅｃｔｏｒＴｃｅｌｌｓｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０５）．ＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ１ＡｉｎＴｃｅｌｌｈａｖｅａｂｅｔｔｅｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｔｈｅＯＳＣＣｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆ
ｅｆｆｅｃｔｏｒＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］㊀ｏｒａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ；ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ；ＨＩＦ⁃１
基金项目：国家自然科学基金（８１９７２５３２，８１７７２８９６，８１６０２３８３）；广州市民生科技产学研协同创新重大研究专项（２０１７０４０２０１０２）
∗
通信作者：王智，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｚｈ７５＠ｍａｉｌ．ｓｙｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
㊀㊀据报道，口腔鳞状细胞癌（ｏｒａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＯＳＣＣ）２０１８年全球新增病例数３５４８６４例，在恶性肿瘤中发病率位于第１９位，死亡率位于第１５位［１］㊂由于近几十年医疗技术的发展，ＯＳＣＣ
患者的５年生存率由６２．７％上升至７１．７％，但仍有
部分患者存在复发率高㊁预后较差的情况［２］㊂因此，急需探究ＯＳＣＣ发生发展的机制，探索新的手段㊂肿瘤浸润淋巴细胞（ｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｌｙｍｐｈｏ⁃ｃｙｔｅｓ，ＴＩＬｓ）是从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，是机体杀灭肿瘤细胞的前沿阵地，其中Ｔ淋巴细胞在抗肿瘤免疫中发挥了重要作用㊂幼稚Ｔ淋巴细胞经肿瘤抗原刺激后可分化为效应Ｔ淋巴细胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔｅｆｆ）和记忆Ｔ淋巴细胞（ｍｅｍｏｒｙＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔｍ），Ｔｍ包括中央型记忆Ｔ淋巴细胞（ｃｅｎｔｒａｌｍｅｍｏｒｙＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔｃｍ）和效应型记忆Ｔ淋巴细胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒｍｅｍｏｒｙＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔｅｍ）［３］㊂研究认为，Ｔｍ细胞依赖氧化磷酸化及脂肪酸氧化为主的代谢方式维持正常生命
活动；当Ｔ淋巴细胞激活后启动代谢重编程，即Ｔｅｆｆ细胞代谢水平明显增加，能量产生的主要途径也从低水平的氧化磷酸化转变为高水平的糖酵解及谷氨酰胺代谢，以支持其生长增殖所必需的核苷酸与脂质合成等基础生命活动［４⁃５］㊂
活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）作为一种短寿命的化学反应自由基，可由氧气通过胞内不同生理活动产生㊂ＲＯＳ一方面影响体内或体外Ｔ淋巴细胞活化Ｔ细胞核因子（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ，ＮＦＡＴ）的激活与白细胞介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）⁃２的产生［６］，另一方面参与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）和Ｍｙｃ的激活，从而调节淋巴细胞代谢和细胞周期［７］㊂Ｆｒａｎｃｈｉｎａ等［８］认为，Ｔ淋巴细胞可能通过调整其ＲＯＳ水平，直接控制代谢重编程，促进Ｔ淋巴细胞活化，引起Ｔ淋巴细胞表型改变㊂低氧诱导因子１（ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１，ＨＩＦ⁃１）在细胞适应氧供应改变中起关键作用，可作为转录因子改变基因表达，通过提高机体携氧能力，增加血液供应，改变代谢方式等途径来适应缺氧环境㊂以往研究中发现，在肿瘤细胞中ＲＯＳ会通过ＨＩＦ⁃１通路来介导肿瘤细胞的代谢重编程［９］㊂然而，肿瘤微环境ＴＩＬｓ代谢方式的转变是否亦依赖于ＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１信号通路还有待进一步研究㊂因此，本文探讨了ＯＳＣＣ患者肿瘤微环境中ＴＩＬｓ与远端正常组织Ｔ淋巴细胞各亚ＲＯＳ表达情况及其参与介导免疫细胞的代谢重编程的分子机制㊂
１　资料与方法
１．１㊀临床样本
连续收取２０１９年１１月至２０２０年１月中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科１０对ＯＳＣＣ组织及远端正常组织样本，所有患者知情同意㊂本研究经中山大学附属口腔医院医学伦理委员会审查批准㊂
１．２㊀主要试剂和仪器
１６４０培养基和胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）购自美国Ｇｉｂｃｏ公司，小鼠抗人抗体ＣＤ３㊁ＣＤ４５ＲＡ㊁ＣＣＲ７抗体及Ｚｏｍｂｉｅ染料均购自美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司，ＲＯＳ试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，胶原酶Ⅳ（５００Ｕ／ｍＬ）购自美国ＭＰｂｉｏ公司，ＤＮＡ酶（５０Ｕ／ｍＬ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司，逆转录试剂盒购自日本Ｔａｋａｒａ公司㊂ＢＤＦＡＣＳ⁃ＶＥＲＳＥ流式细胞仪和ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａＦｕｓｉｏｎ流式细胞分选仪购自美国ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司，ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔ⁃Ｃｙｃｌｅｒ４８０实时荧光定量ＰＣＲ仪购自美国Ｒｏｃｈｅ公司㊂
１．３㊀实验方法
１．３．１㊀细胞分离与制备㊀将新鲜的ＯＳＣＣ和远端正常组织在含有１ｍｇ／ｍＬ胶原酶Ⅳ和０．１ｍｇ／ｍＬ脱氧核糖核酸酶的消化液中剪碎，置于３７ħ摇床，消化１ｈ㊂细胞悬液经７０μｍ细胞滤网过滤后，获得单细胞悬液㊂
１．３．２㊀流式细胞表面标记物染及ＲＯＳ检测㊀使用ＦｃＲ抗体对消化好的单细胞悬液进行封闭（室温，２０ｍｉｎ）；加入Ｚｏｍｂｉｅ染料，充分混匀后４ħ反应３０ｍｉｎ；用流式缓冲液洗涤２次，分别加入ＣＤ３㊁ＣＤ４５ＲＡ㊁ＣＣＲ７抗体，充分混匀后４ħ反应３０ｍｉｎ，流式缓冲液洗涤２次㊂将上述收集的单细胞重悬于１００μＬ的ＤＣＦＨ⁃ＤＡ（ＲＯＳ探针）稀释液（１０μｍｏｌ／Ｌ），细胞培养箱３７ħ孵育２０ｍｉｎ；用无血清细胞培养液洗涤细胞３次㊂细胞重悬后使用流式细胞仪检测，流式数据使用ＦｌｏｗＪｏｖ１０进行分析㊂幼稚Ｔ淋巴细胞为ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋，Ｔｃｍ细胞为ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋，Ｔｅｍ细胞为ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－，Ｔｅｆｆ细胞ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－，圈门策略如图１所示㊂１．３．３㊀实时荧光定量ＲＴ⁃ＰＣＲ检测Ｔ淋巴细胞相关基因㊀癌及正常组织细胞悬液通过流式细胞分选仪进行分选，得到相关Ｔ淋巴细胞㊂将样品裂解得到总ＲＮＡ，利用逆转录试剂盒对总ＲＮＡ进行逆转录，得到ｃＤＮＡ㊂将ｃＤＮＡ在实时荧光定量ＰＣＲ仪上进行反应，以β⁃ＡＣＴＩＮ为内参检测低氧诱导因子１Ａ（ＨＩＦ１Ａ）及葡萄糖转运蛋白１（ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１，ＧＬＵＴ１）㊁己糖激酶２（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ２，ＨＫ２）等糖酵解关键基因的表达，相关基因引物序列见表１㊂１．３．４㊀生物信息技术分析Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ在肿瘤及正常组织的差异表达及其与预后的相关性㊀利用
ＧＥＰＩＡ２数据库（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｐｉａ２．ｃａｎｃｅｒ⁃ｐｋｕ．ｃｎ／）比较Ｔ细胞ＨＩＦ１ＡｍＲＮＡ在头颈肿瘤及远端正常组织的差异表达，并将Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ表达情况与肿瘤患者预后进行相关性分析［１０］㊂
流式细胞术圈门分析ＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞的ＲＯＳ含量和各个亚的比例及ＲＯＳ含量，ＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞从活细胞中圈出后去除粘连细胞得到，幼稚Ｔ淋巴细胞为ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋，Ｔｃｍ细胞为ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋，Ｔｅｍ细胞为ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－，Ｔｅｆｆ细胞为ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－；峰图表示ＲＯＳ含量
图１㊀流式细胞术圈门策略
Ｆｉｇ．１㊀Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｇａｔｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙ１．４㊀统计学方法
使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８软件进行统计学分析，实验结果以均数ʃ标准差表示，组间数据分析选择配对ｔ检验，以Ｐ＜０．０５表示差异具有统计学意义㊂２㊀结㊀果
２．１㊀两种组织中Ｔ淋巴细胞各亚分布情况
ＯＳＣＣ与远端正常组织样本单细胞悬液流式细胞术结果显示，癌与远端正常组织中Ｔ淋巴细胞亚以Ｔｅｆｆ细胞及Ｔｅｍ细胞为主，癌组织中Ｔｅｆｆ细胞比例为（２２．３７ʃ１０．０１）％，高于远
端正常组织中的（１１．０７ʃ７．２０）％（Ｐ＜０．０５）；相反，癌组织中Ｔｅｍ细胞比例为（７７．４８ʃ１０．０９）％低于远端正常组织的（８８．０７ʃ７．３８）％（Ｐ＜０．０５，图２）㊂
表１㊀Ｔ淋巴细胞相关基因引物序列
Ｔａｂ．１㊀ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐａｒｔｉａｌｇｅｎｅｉｎＴｃｅｌｌ
基因名称引物序列（５ᶄң３ᶄ）
β⁃ＡＣＴＩＮ
Ｆ：ＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣ
Ｒ：ＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧ
ＨＩＦ１Ａ
Ｆ：ＡＣＴＴＧＧＣＡＡＣＣＴＴＧＧＡＴＴＧＧ
Ｒ：ＴＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＣＡＧ
ＧＬＵＴ１
Ｆ：ＧＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣ
Ｒ：ＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＴＣＴＣＡＴＣＧＡＡ
ＨＫ２
Ｆ：ＧＴＧＡＡＴＣＧＧＡＧＡＧＧＴＣＣＣＡＣ
Ｒ：ＧＣＴＡＡＣＴＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴ
Ａ：两种组织中Ｔ淋巴细胞分的流式细胞图；Ｂ：两种组织组织中Ｔｅｆｆ和Ｔｅｍ细胞在总Ｔ淋巴细胞中的占比统计图，∗：Ｐ＜０．０５图２㊀肿瘤和远端正常组织中Ｔｅｆｆ和Ｔｅｍ在Ｔ淋巴
细胞的占比
Ｆｉｇ．２㊀ＰｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＴｅｆｆａｎｄＴｅｍｃｅｌｌｓｉｎｏｒａｌｃａｎｃｅｒａｎｄ
ｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅ
２．２㊀两种组织中Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ含量
流式细胞仪检测浸润Ｔ淋巴细胞各亚ＲＯＳ的含量，结果显示：癌组织中Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ含量明显高于远端正常组织（Ｐ＜０．０５，图３）；癌组织中Ｔｅｆｆ细胞ＲＯＳ含量较Ｔｅｍ细胞上调（Ｐ＜０．０５），而远端正常组织中Ｔｅｆｆ细胞与Ｔｅｍ细胞的ＲＯＳ含量差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５，图４）㊂reactive oxygen species (ros)
２．３㊀两种组织中Ｔ淋巴细胞糖酵解相关基因表达量实时荧光定量ＲＴ⁃ＰＣＲ结果显示，ＯＳＣＣ中浸润Ｔ淋巴细胞的ＨＩＦ１Ａ㊁ＧＬＵＴ１㊁ＨＫ２的表达量均高于
远端正常组织Ｔ淋巴细胞（Ｐ＜０．０５，图
５）㊂Ａ：Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ含量峰图；Ｂ：Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ含量统计图；ＭＦＩ：ＤＣＦＨ⁃ＤＡ平均荧光强度；∗：Ｐ＜０．０５
图３㊀ＯＳＣＣ与远端正常组织中Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ含量Ｆｉｇ．３㊀ＲＯＳｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎＯＳＣＣａｎｄｄｉｓｔａｌ
ｎｏｒｍａｌ
ｔｉｓｓｕｅｓ
Ａ：Ｔｅｍ和Ｔｅｆｆ细胞ＲＯＳ含量峰图；Ｂ：Ｔｅｍ和Ｔｅｆｆ细胞ＲＯＳ含量统计图，ＭＦＩ：ＤＣＦＨ⁃ＤＡ平均荧光强度；∗：Ｐ＜０．０５；ｎｓ：Ｐ＞０．０５
图４㊀ＯＳＣＣ和远端正常组织中Ｔｅｍ和Ｔｅｆｆ细胞ＲＯＳ含量Ｆｉｇ．４㊀ＲＯＳｏｆＴｅｍａｎｄＴｅｆｆｃｅｌｌｓｉｎＯＳＣＣａｎｄｄｉｓｔａｌ
ｎｏｒｍａｌ
ｔｉｓｓｕｅｓ
∗：Ｐ＜０．０５
图５㊀肿瘤及远端正常组织中Ｔ淋巴细胞糖酵解相关
基因表达量
Ｆｉｇ．５㊀Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ⁃ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎＴ
ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｂｅｔｗｅｅｎＯＳＣＣａｎｄｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ
２．４㊀Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ在两种组织的差异表达及其与预后的相关性分析
ＧＥＰＩＡ２数据库分析结果显示，Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ水
平在肿瘤组织中高于远端正常组织，但无统计学差异（Ｐ＞０．０５）；肿瘤组织中效应Ｔ细胞的ＨＩＦ１Ａ水平明显高于远端正常组织，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；Ｔ细胞高表达ＨＩＦ１Ａ的肿瘤相对预后较好
（Ｐ＜０．０５，图６）㊂
Ａ：Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ在肿瘤及远端正常组织的差异表达；Ｂ：效应Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ在肿瘤及远端正
常组织的差异表达；Ｃ：Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ表达水平与预后的相关性
图６㊀Ｔ细胞ＨＩＦ１Ａ在肿瘤及远端正常组织的差异表达
及其与预后的相关性
Ｆｉｇ．６㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌＨＩＦ１ＡｉｎｔｕｍｏｒａｎｄｄｉｓｔａｌｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｉｓｖａｌｕｅｏｆｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＴ
ｃｅｌｌＨＩＦ１Ａｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ
３㊀讨㊀论
ＯＳＣＣ中肿瘤微环境成分多样㊁机制复杂，其中
Ｔ淋巴细胞作为ＴＩＬｓ的重要成分之一，在肿瘤微环境中发挥重要的抗肿瘤免疫作用，研究其不同亚间转化及潜在的代谢调控方式，将有助于我们从代谢重编程的角度探讨肿瘤免疫效应新机制，为Ｔ淋
巴细胞的活化提供新策略㊂本研究结果显示，ＯＳＣＣ与远端正常组织中Ｔ淋巴细胞主要以Ｔｅｍ及Ｔｅｆｆ两大亚为主㊂与远端正常组织相比，癌组织中主要为Ｔｅｆｆ浸润，而远端正常组织则以Ｔｅ
ｍ居多㊂表明Ｔ淋巴细胞在肿瘤微环境中经历了一定程度的代谢重编程，使Ｔｅｍ细胞持续转换为Ｔｅｆｆ细胞，无法维持自我更新能力㊂
２０世纪３０年代，德国生物学家ＯｔｔｏＷａｒｂｕｒｇ发现肿瘤细胞主要依赖糖酵解方式进行能量代谢，消耗大量葡萄糖并产生乳酸，称为Ｗａｒｂｕｒｇ效应，是肿瘤十大生物学特征之一［１１］㊂这种能量代谢方式使得肿瘤细胞能够适应因为快速增长而导致的局部乏氧㊁养份不足等不利的环境［１２］㊂近期研究结果表明，幼稚Ｔ淋巴细胞和Ｔｅｍ细胞通常依赖于氧化磷酸化维持生存；受抗原刺激后，Ｔ淋巴细胞会从具有更长寿命和更大记忆潜力的细胞，进一步分化为短寿命效应细胞Ｔｅｆｆ，启动代谢重编程，代谢方式以糖酵解为主，这是活化Ｔ淋巴细胞的标志之一［１３⁃１４］㊂代谢活动与Ｔ淋巴细胞的命运和功能密切相关㊂新近研究表明，肿瘤微环境中Ｌ⁃精氨酸水平升高可逆转Ｔ淋巴细胞代谢方式  从糖解切换成氧化磷酸化，促进Ｔｅｍ细胞的生成与维持［３］㊂ＲＯＳ在肿瘤微环境中对浸润Ｔ淋巴细胞活化的调控也可能依赖代谢途径㊂有学者提出，肿瘤微环境中的ＲＯＳ水平必须缓冲到 最佳点 ，以允许代谢重编程，调控Ｔ淋巴细胞增殖㊁激活与分化［１５］㊂本研究发现，ＯＳＣＣ肿瘤组织中ＲＯＳ水平高于远端正常组织，Ｔｅｆｆ比例较高，且癌组织中Ｔｅｆｆ细胞ＲＯＳ较Ｔｅｍ表达量上调，提示肿瘤微环境中ＲＯＳ的升高与Ｔ细胞表型改变高度相关，肿瘤微环境中ＲＯＳ水平可能通过依赖代谢的途径逆转Ｔｅｆｆ细胞表型，为ＴＩＬｓ中Ｔｅｍ细胞的维持与活化提供新策略㊂
同时，作为ＨＩＦ⁃１Ａ下游靶标的ＧＬＵＴ１㊁ＨＫ２是糖酵解的关键基因，可以表征细胞的糖酵解水
平㊂本研究发现，癌的浸润Ｔ淋巴细胞中ＧＬＵＴ１㊁ＨＫ２表达高于远端正常组织Ｔ淋巴细胞，这也进一步说明癌的浸润Ｔ淋巴细胞糖酵解水平高于远端正常组织Ｔ淋巴细胞㊂同时ＯＳＣＣ的浸润Ｔ淋巴细胞ＨＩＦ１Ａ表达也高于远端正常组织Ｔ淋巴细胞㊂ＯＳＣＣ浸润Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１通路改变与Ｔ淋巴细胞代谢重编程及活化存在相关性，这也能够解释肿瘤浸润Ｔ淋巴细胞中具有高比例的Ｔｅｆｆ这一现象（图７）㊂这一复杂的调控机制将在后期研究中深入探索㊂
综上所述，本研究以分析ＯＳＣＣ患者癌与远端正常组织Ｔ淋巴细胞分及各亚ＲＯＳ表达特征为目的，探讨肿瘤微环境中ＲＯＳ对肿瘤浸润Ｔ淋巴细胞表型转化的潜在作用，结果显示肿瘤微环境中浸润Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ表达明显上升，Ｔｅｆｆ细胞ＲＯＳ表达较Ｔｅｍ高；ＲＯＳ／ＨＩＦ１通路的上调引起下游靶基因ＧＬＵＴ１㊁ＨＫ２的上调又与肿瘤浸润Ｔ细胞中高比例的Ｔｅｆｆ存在高度相关性；肿瘤浸润Ｔ淋巴细胞高表达ＨＩＦ１Ａ预示肿瘤患者较好的预后
㊂
红箭头：细胞亚的转换；蓝箭头：信号通路的正调控
图７㊀ＯＳＣＣ浸润Ｔ淋巴细胞ＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１通路改变与Ｔ淋巴细胞代谢重编程及活化的相关性
Ｆｉｇ．７㊀ＴｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＲＯＳ／ＨＩＦ⁃１ｐａｔｈｗａｙａｎｄＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＯＳＣＣ
［参㊀考㊀文㊀献］
［１］㊀ＢｒａｙＦ，ＦｅｒｌａｙＪ，ＳｏｅｒｊｏｍａｔａｒａｍＩ，ｅｔａｌ．Ｇｌｏｂａｌｃａｎｃｅｒｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ２０１８：ＧＬＯＢＯＣＡＮｅｓｔｉｍａｔｅｓｏｆｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｗｏｒｌｄｗｉｄｅｆｏｒ３６ｃａｎｃｅｒｓｉｎ１８５ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＣＡＣａｎｃｅｒＪＣｌｉｎ，２０１８，６８（６）：３９４⁃４２４［２０２０⁃０７⁃１９］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３２２／ｃａａｃ．２１４９２．㊀㊀㊀
［２］㊀Ｃａｐｏｔｅ⁃ＭｏｒｅｎｏＡ，ＢｒａｂｙｎＰ，Ｍｕñｏｚ⁃ＧｕｅｒｒａＭＦ，ｅｔａｌ．Ｏｒａｌｓｑｕａ⁃ｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｙａｎｄｒｉｓｋｆａｃｔｏｒａｓｓｅｓｓ⁃ｍｅｎｔｂａｓｅｄｏｎａ３９⁃ｙｅａｒｓｅｒｉｅｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＩｎｔＪＯｒａｌＭａｘｉｌｌｏｆａｃＳｕｒｇ，２０２０：Ｓ０９０１⁃５０２７（２０）３０１００⁃４［２０２０⁃０７⁃１９］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６
／ｊ．ｉｊｏｍ．２０２０．０３．００９．
［３］㊀ＷｕＸ，ＷｕＰ，ＳｈｅｎＹ，ｅｔａｌ．ＣＤ８＋ｒｅｓｉｄｅｎｔｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌｓａｎｄｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，２０１８，９：２０９３［２０２０⁃０７⁃１９］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０２０９３．［４］㊀ＰａｌｍｅｒＣＳ，ＨｕｓｓａｉｎＴ，ＤｕｅｔｔｅＧ，ｅｔａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｇｌｕｃｏｓｅｍｅ⁃ｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＣＤ４＋ａｎｄＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＩｎｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２０１６，３５（６）：４７７⁃４８８［２０２０⁃０７⁃１９］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３１０９／０８８３０１８５．２０１５．１０８２１７８．
［５］㊀ＪｏｈｎｓｏｎＭＯ，ＷｏｌｆＭＭ，ＭａｄｄｅｎＭＺ，ｅｔａｌ．ＤｉｓｔｉｎｃｔＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｈ１７ａｎｄＴｈ１ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｙＧｌｕｔａｍｉｎａｓｅ⁃ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＭｅ⁃ｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ／ＯＬ］．Ｃｅｌｌ，２０１８，１７５（７）：１７８０⁃１７９５．ｅ１９［２０２０⁃０７⁃１９］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．１０．００１．［６］㊀ＪａｃｋｓｏｎＳＨ，ＤｅｖａｄａｓＳ，ＫｗｏｎＪ，ｅｔａｌ．Ｔｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓａｐｈａｇｏ⁃ｃｙｔｅ⁃ｔｙｐｅＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅｔｈａｔｉｓａｃｔｉｖａｔｅｄａｆｔｅｒＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，２００４，５（８）：８１８⁃８２７．
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