甘草酸通过ROS依赖性NLRP3炎性通路减轻
缺氧H9c2细胞损伤的实验研究
臧雨宸，王胜娟
摘要目的：观察甘草酸(GA)对缺氧H9c2细胞炎症㊁氧化应激的影响，并探讨其潜在作用机制㊂方法：将正常培养的H9c2细胞设置为对照组，缺氧培养H9c2细胞设置为缺氧组;GA㊁GA+N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理的缺氧H9c2细胞设置为缺氧+GA组㊁缺
氧+GA+NAC组；将生理盐水㊁双蒸水+GA处理的缺氧H9c2细胞设置为缺氧+生理盐水组㊁缺氧+GA+双蒸水组㊂采用细胞计数试剂盒(CCK8)㊁5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染法测定细胞增殖；酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清肿瘤坏死因子α(TNF-α)㊁白细胞介素(IL)-6㊁IL-1β㊁丙二醛(MDA)㊁超氧化物歧化酶(SOD)；免疫荧光法检测细胞活性氧(ROS)；实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞NOD样受体蛋白3(NLPR3)mRNA表达㊂结果：与对照组比较，缺氧组H9c2细胞存活率㊁EdU阳性率均降低，细胞上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β㊁MDA含量及ROS㊁NLRP3mRNA水平均升高,SOD含量降低(P<0.05)；与缺氧+生理盐水组比较，缺氧+GA组H9c2细胞存活率㊁EdU阳性率均升高，细胞上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β㊁MDA含量及ROS㊁NLRP3mRNA水平均降低,SOD含量升高(P<0.05)㊂与缺氧+GA+双蒸水组比较，缺氧+GA+NAC组H9c2细胞ROS㊁NLRP3及TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β㊁MDA降低,SOD含量升高(P<0.05)㊂结论:GA可减轻缺氧诱导H9c2细胞的炎症㊁氧化应激反应，其机制与抑制ROS依赖性NLRP3炎性通路有关㊂
关键词缺氧诱导H9c2细胞；甘草酸；炎症；氧化应激；活性氧依赖性NOD样受体蛋白3炎性通路；实验研究
d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.16.007
Experimental Study of Glycyrrhetinic Acid Alleviating Hypoxia Induced H9c2Cell Injury through ROS-dependent NLRP3Inflammatory Pathway
ZANG Yuchen,WANG Shengjuan
Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University,Beijing100038,China,E-mail:********************
Abstract Objective:To observe the effects of glycyrrhetinic acid(GA)on inflammation and oxidative stress of hypoxic H9c2cells. Methods:Normal cultured H9c2cells were set as the control group,and hypoxic cultured H9c2cells were set as the hypoxia group, hypoxic H9c2cells treated with GA and GA N-acetyl-L-cysteine(NAC)were set as hypoxia+GA group and hypoxia+NAC group, normal saline,double distilled water+GA-treated hypoxic H9c2cells were set as hypoxia+normal saline group,hypoxia+GA+double distilled water group.Cell proliferation was measured by cell counting kit(CCK8),5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)staining method.The levels of tumor necrosis factorα(TNF-α),interleukin(IL)-6,IL-1β,malondialdehyde(MDA),and superoxide dismutase(SOD)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Reactive oxygen species(ROS)was detected by immunofluorescence.The mRNA expression of NOD-like receptor protein3(NLRP3)was detected by re
al-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results:H9c2cell survival and EdU positivity in the hypoxia group decreased,cell supernatant TNF-α,IL-6,IL-1β,MDA content and ROS,NLRP3mRNA levels increased,and SOD content decreased(P<0.05).Compared with the hypoxia+normal saline group,H9c2cell survival and EdU positivity in the hypoxia+GA group increased,cell supernatant TNF-α,IL-6, IL-1β,MDA content and ROS,NLRP3mRNA levels decreased,and SOD content increased(P<0.05).Compared with the hypoxia+GA+ double-distilled water group,ROS,NLRP3,TNF-α,IL-6,IL-1β,MDA of H9c2cells in the hypoxia+GA+NAC group decreased,and SOD content increased(P<0.05).Conclusion:Glycyrrhetinic acid could alleviate hypoxia-induced inflammatory,oxidative stress in H9c2 cells,and its mechanism might be related to the inhibition of ROS-dependent NLRP3inflammatory pathway.
Keywords hypoxia induced H9c2cells;Glycyrrhetinic acid;inflammation;oxidative stress;reactive oxygen species dependent NOD-like receptor protein3inflammatory pathway;experimental study
基金项目北京市卫生科技发展专项基金项目(No.2018-7-110)
作者单位首都医科大学附属北京世纪坛医院(北京100038),E-mail:********************
引用信息臧雨宸，王胜娟.甘草酸通过ROS依赖性NLRP3炎性通路减轻缺氧H9c2细胞损伤的实验研究[J].
中西医结合心脑血管病杂志,2023,21 (16):2951-2956.
心肌梗死是由缺氧或急性持续性缺血引起，导致不可逆的心肌损伤和心力衰竭[1-2]㊂尽管预防和心肌梗死的医疗技术水平有较大提高，但心肌梗死死亡率未见明显下降㊂甘草酸(glycyrrhetinic acid,GA)是一种从甘草中分离出来的苷元皂苷，具有抗炎㊁抗氧化应激㊁抗肿瘤㊁保肝㊁抗过敏㊁解毒等多种药用效果[3-4]㊂现代药理研究发现,GA在心脏相关疾病中具有保护作用[5]，但其发挥作用的机制仍需继续探讨㊂活性氧(ROS)主要由线粒体释放，细胞积累过多可激活NOD样受体蛋白3(NLPR3)炎症小体，进而募集半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)，引起细胞死亡[6-7]㊂本研究观察GA对缺氧H9c2细胞炎症㊁氧化应激的影响，并探讨其潜在作用机制㊂
1材料与方法
1.1实验材料
H9c2心肌细胞购自中国(上海)科学研究院细胞库;GA(批号:1405-86-3；纯度>99%)购自美国Abmole公司;N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(批号:616-91-1)购自上海生工生物；细胞计数试剂盒(CCK8)购自美国GlpBio;5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)-488细胞增殖检测试剂盒购自上海BeyoClick；人肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒㊁人白细胞介素(IL)-6检测试剂盒㊁人IL-1β检测试剂盒㊁人丙二醛(MDA)含量检测试剂盒㊁超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒均购自日本TAKERA;ROS荧光检测分析试
剂盒购自武汉艾美捷科技;RNA抽提试剂盒㊁反转录试剂盒及实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒购自北京索莱宝生物技术公司；实验所用引物的设计㊁合成由上海吉玛基因提供㊂
1.2方法
1.2.1细胞培养
使用混合10%胎牛血清和1%双抗(青链霉素)的DMEM培养基培养H9c2细胞,37ħ㊁5%CO2恒温细胞培养箱培养，隔日更换1次培养基㊂
1.2.2细胞分组与处理
将正常培养的H9c2细胞分为对照组㊁缺氧组㊁缺氧+生理盐水组㊁缺氧+GA组㊁缺氧+GA+双蒸水组㊁缺氧+GA+NAC组㊂对照组为常规条件下培养的H9c2细胞；缺氧组为1%O2㊁94%N2㊁5%CO2的气体条件下培养24h的H9c2细胞；缺氧+生理盐水组㊁缺氧+GA组为生理盐水及其配制的10μmol/L的GA溶液处理12h的H9c2细胞；缺氧+GA+双蒸水组㊁缺氧+GA+NAC组为双蒸水㊁10mmol/L的NAC 处理4h的缺氧+GA组H9c2细胞㊂1.2.3CCK8检测细胞增殖
收集待检细胞，培养液调至0.5ˑ105个/mL，接种于96孔板上，每孔200μL㊂每孔10μL的CCK8反应液，震荡混匀，孵育20min㊂结束后上酶标仪检测细胞的吸光度(OD490)㊂细胞存活率(%)=OD490实验组/ O
D490对照组ˑ100%㊂
1.2.4EdU染检测细胞增殖
收集待检测细胞，培养液调至0.5ˑ105个/mL, 200μL取接种96孔板㊂每孔加入50μmol/L的EdU, 37ħ温箱孵育3h㊂使用4%多聚甲醛固定30min, GA中和处理5min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗㊂0.5%的Triton渗透剂脱摇床孵育10min,PBS清洗㊂最后用二脒基苯基吲哚(DAPI)染细胞核㊂使用荧光显微镜检测细胞中EdU染细胞㊂EdU阳性率(%)= EdU阳性细胞数(红荧光)/细胞总数(蓝荧光)ˑ100%㊂
1.2.5ELISA检测细胞上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β㊁MDA㊁SOD含量
收集对数期各组细胞的培养液上清，按照TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β㊁MDA㊁SOD的ELISA试剂盒要求操作，检测上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β㊁MDA㊁SOD含量㊂
1.2.6荧光探针检测细胞ROS
将待测细胞调至0.5ˑ105个/mL，每孔100μL接种在96孔板，每孔100μL无血清培养基饥饿处理12h㊂弃去上清，同时避免划伤底部的细胞㊂按照ROS活性检测试剂盒说明书要求操作,1000倍稀释DCFH-DA 荧光探针，每孔40μL,37ħ孵育4h㊂取出细胞, DAPI染细胞核，荧光显微镜下拍照，酶标仪设置激发波长480nm，发射波长525nm测定细胞的荧光活性㊂1.2.7RT-qPCR检测细胞NLRP3mRNA表达
RNA抽提试剂盒㊁反转录试剂盒提取细胞RNA 并合成cDNA，作为qPCR实验的模板㊂qPCR试剂盒检测分析样本NLRP3mRNA水平㊂GAPDH作为内参,2-әәCt法计算结果㊂引物信息:NLRP3正向引物5'-CCGGGTCTAGCTGGTGAAAG-3'，反向引物5'-TCTCCTCTAGGTCCTAACGGG-3';GAPDH正向引物5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'，反向引物5'-ACTGAGTGTGGCAGGGACTC-3'㊂反应程序中95ħ预变性,59ħ退火，反应40个循环㊂
1.3统计学处理
采用PEMS3.0㊁Graphpad Prism8.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验㊂以P<0.05为差异有
统计学意义㊂
2结果
2.1GA对缺氧诱导H9c2细胞增殖的影响
与对照组比较，缺氧组H9c2细胞存活率降低,EdU阳性率降低(P<0.05)；与缺氧+生理盐水组比较，缺氧+GA组H9c2细胞存活率㊁EdU阳性率均升高(P<0.05)㊂详见图1㊁表1㊂
图1EdU染检测各组细胞的增殖情况
表1GA对缺氧诱导H9c2细胞增殖的影响(xʃs)单位:%组别细胞数量细胞存活率EdU阳性率
对照组9100.01ʃ11.0382.13ʃ10.05
缺氧组964.58ʃ7.11①35.72ʃ4.19①
缺氧+生理盐水组965.14ʃ6.8936.11ʃ4.42
缺氧+GA组984.95ʃ9.14②63.78ʃ7.22②
F值34.68497.174
P<0.001<0.001注：缺氧组与对照组比较,①P<0.05；缺氧+GA组与缺氧+生理盐水组比较,②P<0.05㊂
2.2GA对缺氧诱导H9c2细胞上清炎性因子分泌的影响
与对照组比较，缺氧组H9c2细胞上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β含量均升高(P<0.05)；与缺氧+生理盐水组比较，缺氧+GA组H9c2细胞上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β含量均降低(P<0.05)㊂详见表2㊂
表2GA对缺氧诱导H9c2细胞上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β含量的影响(xʃs)单位:pg/mL 组别细胞数量TNF-αIL-6IL-1β
对照组97.32ʃ0.937.55ʃ0.89  3.84ʃ0.63
缺氧组926.59ʃ2.65①32.18ʃ3.19①37.89ʃ4.88①缺氧+生理盐水组926.65ʃ2.7832.31ʃ3.4737.93ʃ4.27
缺氧+GA组914.52ʃ1.55②18.55ʃ1.99②20.24ʃ2.25②F值181.423190.865203.021
P<0.001<0.001<0.001注：缺氧组与对照组比较,①P<0.05；缺氧+GA组与缺氧+生理盐水组比较,②P<0.05㊂
2.3GA对缺氧诱导H9c2细胞氧化应激的影响
与对照组比较，缺氧组H9c2细胞上清SOD含量降低,MDA含量升高(P<0.05)；与缺氧+生理盐水组比较，缺氧+GA组H9c2细胞上清SOD含量升高, MDA含量降低(P<0.05)㊂详见表3㊂
2.4GA对缺氧诱导H9c2细胞ROS㊁NLRP3水平的调控
与对照组比较，缺氧组H9c2细胞ROS荧光活性上升,NLRP3mRNA表达升高(P<0.05)；与缺氧+生理盐水组比较，缺氧+GA组H9c2细胞ROS荧光活性下降,NLRP3mRNA表达降低(P<0.05)㊂详见图2㊁表4㊂
表3GA对缺氧诱导H9c2细胞上清SOD㊁
MDA含量的影响(xʃs)
组别细胞数量SOD(U/mL)MDA(μmol/mL)对照组923.15ʃ2.66  1.62ʃ0.20缺氧组9  5.73ʃ0.86①7.69ʃ0.91①缺氧+生理盐水组9  5.76ʃ0.697.72ʃ0.89缺氧+GA组913.66ʃ1.48②  4.13ʃ0.71②F值235.045146.816
P<0.001<0.001注：缺氧组与对照组比较,①P<0.05；缺氧+GA组与缺
氧+生理盐水组比较,②P<0.05㊂
图2各组细胞的ROS荧光图
表4GA对缺氧诱导H9c2细胞ROS㊁NLRP3mRNA表达的影响(xʃs)组别细胞数量ROS(MFI)NLRP3mRNA 对照组9452.13ʃ33.650.68ʃ0.09缺氧组91475.35ʃ156.78①  5.31ʃ0.59①缺氧+生理盐水组91469.37ʃ160.13  5.39ʃ0.66缺氧+GA组9729.49ʃ89.57②  3.01ʃ0.32②F值264.835291.333 P<0.001<0.001注：缺氧组与对照组比较,①P<0.05；缺氧+GA组与缺氧+生理盐水组比较,②P<0.05㊂
2.5NAC处理对GA调控缺氧诱导H9c2细胞炎性因子分泌㊁氧化应激水平的调控
与缺氧+GA+双蒸水组比较，缺氧+GA+NAC 组H9c2细胞ROS荧光活性下降,NLRP3mRNA表达降低，细胞上清TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β㊁MDA含量均降低, SOD升高(P<0.05)㊂详见表5㊂
表5NAC处理对GA抑制缺氧H9c2细胞炎症㊁氧化应激作用的影响(xʃs)
reactive oxygen species (ros)组别细胞数量ROS(MFI)NLRP3mRNA TNF-α(pg/mL)缺氧+GA组9732.48ʃ82.14  3.12ʃ0.4815.04ʃ1.66
缺氧+GA+双蒸水组9735.82ʃ80.89  3.20ʃ0.5215.10ʃ1.73
缺氧+GA+NAC组9538.62ʃ60.33①  1.13ʃ0.17①10.44ʃ1.37①
F值20.32970.09925.304
P<0.001<0.001<0.001
组别IL-6(pg/mL)IL-1β(pg/mL)SOD(U/mL)MDA(μmol/mL)缺氧+GA组18.73ʃ2.0122.13ʃ2.4414.66ʃ1.75  4.26ʃ0.64缺氧+GA+双蒸水组18.76ʃ2.1121.98ʃ2.3514.71ʃ1.68  4.32ʃ0.69缺氧+GA+NAC组12.78ʃ1.58①8.21ʃ0.87①20.31ʃ2.39①  2.88ʃ0.36①F值29.143141.03724.55717.647
P<0.001<0.001<0.001<0.001注：缺氧+GA+NAC组与缺氧+GA+双蒸水组比较,①P<0.05㊂
3讨论
GA在较多肝脏疾病中具有保肝作用[8-9]，在心脏缺血再灌注损伤中可降低敏感性和室性心律失常的发生
[10]㊂Zhang等[11]通过㊁甘草苷和GA的正交组合观察心肌细胞的损伤发现，可降低心肌细胞存活率，下调钠/钙交换体(NCX1)和二氢喋呤还原体-α1(DHPR-α1)表达，上调ryanodine受体2型(RyR2)表达，具有明显的损伤作用，与甘草苷或GA配伍可不同程度减轻对心肌细胞的损伤，提示甘草苷㊁GA可调节钙相关蛋白表达进而保护心肌细胞㊂Wang等[12]研究显示,GA不仅可改善氧糖剥夺H9c2细胞核大小㊁染质浓缩，同时以剂量依赖性方式降低细胞凋亡率和乳酸脱氢酶(LDH)㊁肌酸激酶同工酶(CK-MB)和IL-1β水平;GA可增加Bcl-2蛋白表达，降低了Caspase-8和Bax蛋白表达，提高了Bcl-2/Bax比值，增加了磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白的表达，说明GA以剂量依赖性减少H9c2细胞凋亡的作用机制与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路有关㊂
本研究结果显示,GA可减弱缺氧H9c2细胞的增殖抑制，增加了细胞存活率和EdU阳性率，说明GA 有益于提高H9c2细胞的缺氧耐受力㊂进一步研究显示,GA抑制了致炎细胞因子TNF-α㊁IL-6㊁IL-1β和MDA分泌，促进SOD分泌，提示GA具有抗缺氧诱导的炎症和氧化应激作用㊂GA发挥心脏保护作用的潜在机制有待进一步深入探讨㊂
NLRP3炎性小体主要由线粒体产生，可被ROS㊁钙异常㊁融合蛋白及双磷脂酰甘油激活[13]㊂ROS是激活NLRP3成熟为NLRP3炎性小体的重要第二信使[14]㊂NAC具有双重活性，即活性氧和蛋白酶抑制作用㊂有研究显示,NAC保护心肌细胞是通过抑制活性氧保护心肌缺血/再灌注损伤，而不是蛋白酶[15]㊂Dai 等[16]通过建立败血症小鼠模型发现，脂多糖诱导的脓毒症小鼠伴有心功能降低和心肌损伤，消皮素D

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