[收稿日期]㊀2020-08-28[修回日期]㊀2020-10-27
[基金项目]㊀国家自然科学基金(31670962,81370378)；湖南省卫健委临床重大专项(20200011-1003)；湖南省大学生创新创
业训练计划项目(S201910555137)
[作者简介]㊀章舒蕾，硕士研究生，研究方向为动脉粥样硬化病因发病学与防治基础,E-mail 为1029645492@qq㊂通信作者危当恒，博士，教授，博士研究生导师，研究方向为动脉粥样硬化病因发病学与防治基础,E-mail 为759353094@qq㊂
㊃实验研究㊃
[文章编号]㊀1007-3949(2021)29-01-0042-06
琥珀酸通过活性氧途径诱导人脐静脉内皮细胞焦亡
章舒蕾，梁亚敏，罗涔方，危当恒
(南华大学心血管疾病研究所动脉硬化学湖南省重点实验室湖南省动脉硬化性疾病国际科技创新合作基地,
湖南省衡阳市421001)
[关键词]㊀琥珀酸;㊀人脐静脉内皮细胞;㊀线粒体;㊀活性氧;㊀焦亡;㊀动脉粥样硬化
[摘㊀要]㊀目的㊀探讨琥珀酸对人脐静脉内皮细胞(HUVEC )焦亡的影响及其调控机制㊂方法㊀用琥珀酸类似物琥珀酸二乙酯(DS )处理HUVEC 24h ，比法检测细胞内琥珀酸含量,Western blot 检测细胞焦亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(Caspase-1)㊁白细胞介素1β(IL-1β)㊁IL-18㊁NOD 样受体蛋白3(NLRP3)㊁消皮素D N 端(GSDMD-N )的含量;ATP 测定试剂盒以及活性氧(ROS )荧光探针分别检测琥珀酸对HUVEC 的ATP 以及ROS 生成的影响㊂ROS 清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC )检测ROS 在琥珀酸诱导HUVEC 焦亡中的作用㊂琥珀酸氧化抑制剂丙二酸二甲酯(DMM )检测琥珀酸氧化代谢对ROS 产生的影响㊂结果㊀DS 促HUVEC 内琥珀酸蓄积，上调焦亡相关蛋白Caspase-1㊁IL-1β㊁IL-18㊁GSDMD-N 和NLRP3的表达，抑制ATP 生成并上调ROS 产生㊂NAC 抑制琥珀酸诱导的ROS 生成，并下调上述焦亡相关蛋白的表达㊂DMM 下调琥珀酸诱导的ROS 产生以及HUVEC 的焦亡㊂结论㊀琥珀酸通过氧化代谢上调ROS 生成，进而促进HUVEC 焦亡㊂[中图分类号]㊀R54
[文献标识码]㊀A
Succinate induces pyroptosis of human umbilical vein endothelial cells via reactive ox-ygen species pathway
ZHANG Shulei,LIANG Yamin,LUO Cenfang,WEI Dangheng
(Institute of Cardiovascular Disease &Key Laboratory for Arteriosclerology of Hunan Province &Hunan International Scientif-ic and Technological Cooperation Base of Arteriosclerotic Disease ,Hengyang Medical College ,University of South China ,
Hengyang ,Hunan 421001,China )[KEY WORDS ]㊀succinate;㊀human umbilical vein endothelial cell;㊀mitochondria;㊀reactive oxygen species;㊀py-roptosis;㊀atherosclerosis
[ABSTRACT ]㊀㊀Aim ㊀To investigate the effect of succinate on pyroptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)and its regulatory mechanism.㊀㊀Methods ㊀HUVECs were treated with succinate analogue diethyl succinate (DS)for 24h,and the content of succinate was detected by colorimetry.㊀Western blot was used to detect the expressions of pyroptosis-related protein cysteinyl aspartate specific proteinase 1(Caspase-1),interleukin-1β(IL-1β),IL-18,NOD-like receptor protein 3(NLRP3),gasdermin D N termine (GSDMD-N).㊀The effects of succinate on ATP and reactive oxygen species (ROS)production of HUVEC were detected by ATP assay kit and ROS fluorescent probe.㊀ROS scavenger N-acetylcysteine (NAC)was used to observe the role of ROS in HUVEC pyroptosis induced by succinate.㊀Dimethyl mal-onate (DMM),a succinate oxidation inhibitor,was used to detect t
he effect of succinate oxidative metabolism on ROS pro-duction.㊀㊀Results ㊀DS promoted the accumulation of succinate in HUVEC,up-regulated the expressions of pyroptosis-
related proteins Caspase-1,IL-1β,IL-18,GSDMD-N and NLRP3,inhibited ATP production and up-regulated ROS pro-duction.㊀NAC inhibited the production of ROS induced by succinate and down-regulated the expressions of above pyropto-sis-related proteins.㊀DMM down-regulated succinate-induced ROS production and HUVEC pyroptosis.㊀㊀Conclusion ㊀Succinate up-regulates ROS production through oxidative metabolism,thus promoting HUVEC pyroptosis.
㊀㊀动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)为慢性炎症性病理过程，血管内皮细胞炎性活化为As发生发展过程的重要环节[1]㊂近来的研究发现，三羧酸循环中间体及其衍生物通过 非能量代谢途径 调控细胞功能并参与As的发生发展进程[2]㊂琥珀酸为三羧酸循环重要的中间代谢产物，其促进炎症因子的释放以及血管内皮细胞的损伤[3]㊂琥珀酸上调小鼠骨髓来源的树突状细胞白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达[4]㊂高糖通过琥珀酸/G蛋白偶联受体91(G-protein coupled receptor 91,GPR91)信号促进血管紧张素Ⅱ释放，损伤人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)[5]㊂Koenis等[6]发现Nur77敲除促As病变，该模型小鼠血清琥珀酸水平明显增加，并且Nur77-/-的巨噬细胞中琥珀酸大量积蓄，但琥珀酸积蓄与血管内皮细胞炎性活化间关系尚不清楚㊂血管内皮细胞焦亡(炎性㊁程序性细胞死亡)发生于As进程，并与As的稳定性密切相关[7]㊂在焦亡过程中,Nod样受体蛋白3(NOD-like receptor pr
o-tein3,NLRP3)炎性小体被活化，半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase1,Caspase-1)前体蛋白被激活，并介导IL-1β和IL-18的加工和成熟㊁活化及裂解消皮素D (gasdermin D,GSDMD)㊂此外,Pro-Caspase-1还能直接裂解GSDMD触发焦亡，参与血管内皮细胞的损伤以及炎性活化[8-9]㊂活性氧(reactive oxygen species,ROS)是细胞焦亡重要的诱导分子,Koenis 等[6]发现琥珀酸大量蓄积的Nur77-/-巨噬细胞伴随有大量的ROS产生㊂因此，本文采用外源性的琥珀酸类似物观察琥珀酸对血管内皮细胞ROS产生以及焦亡的影响，以探讨琥珀酸对血管内皮细胞炎性活化的影响及其机制㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀细胞株与试剂
HUVEC购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，琥珀酸二乙酯(diethyl succinate, DS)㊁丙二酸二甲酯(dimethyl malonate,DMM)㊁N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)购自TCI(上海)化成工业发展有限公司，琥珀酸比测定试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司,DMEM高糖培养基㊁胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司,ATP测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所,ROS检测荧光探针二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)购自江苏凯基生物技术股份有限公司,BCA蛋白定量试剂盒购自中国上海康为世纪生物科技有限公司，消皮素D N端(GSDMD-
N)㊁IL-1β㊁GAPDH㊁Caspase-1㊁NLRP3抗体购自美国Proteintech公司,IL-18抗体购买于美国GeneTex 公司㊂
1.2㊀HUVEC培养与处理
HUVEC采用含10%FBS的DMEM高糖培养基培养，加入琥珀酸类似物DS(可显著增加胞质和线粒体基质中的琥珀酸),DS的终浓度为10mmol/L;
2.5mmol/L NAC预处理3h后加入DS处理24h，观察ROS对DS诱导的血管内皮细胞焦亡的影响; DMM预处理6h后加入DS处理24h，观察琥珀酸氧化代谢途径对血管内皮细胞ROS产生以及焦亡的影响,DMM的浓度10mmol/L㊂
1.3㊀BCA蛋白定量法
按照说明书处理样品，用酶标仪在562nm波长处测定并记录吸光度，根据标准曲线计算样品中蛋白浓度㊂
1.4㊀ATP含量测定
将收集好的细胞加入90~100ħ双蒸水，置于热水浴(90~100ħ)中将其匀浆破碎，后将细胞悬液于沸水浴
中加热10min，取出细胞悬液用1mL移液混匀1min㊂然后按照说明书加试剂，最后混匀，常温静置5min㊂检测波长为636nm，光径为0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值，保存并分析结果㊂
1.5㊀ROS荧光探针DHE检测
reactive oxygen species (ros)
从培养箱中取出处理好的细胞，用PBS洗3次㊂加入终浓度为50μmol/L的DHE液，在37ħ水浴箱避光条件下孵育45min,PBS清洗细胞3次，每次6min㊂荧光显微镜拍照，保存并分析结果㊂1.6㊀Western blot检测蛋白的表达
收集细胞，使用预冷的PBS洗3次，加入裂解液后4ħ静置30min,12000r/min离心10min，取上清后采用BCA法进行蛋白定量㊂目的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2h，加入单克隆抗体GSDMD (1ʒ1000)㊁IL-1β(1ʒ1000)㊁IL-18(1ʒ1000)㊁Caspase-1(1ʒ1000)㊁NLRP3(1ʒ1000)㊁GAPDH (1ʒ2000)4ħ孵育过夜,TBST洗3次，每次10 min，相应二抗室温孵育2h,ECL发光试剂显，拍照并保存结果㊂
1.7㊀琥珀酸含量测定
收集细胞，在冰中快速匀浆，加入100μL低温
琥珀酸测定缓冲液，以10000r /min 离心10min ，收集上清液㊂采用琥珀酸比测定试剂盒，加入各反
应物，在37ħ下避光孵育30min ,450nm 波长处测定吸光度㊂
1.8㊀统计学方法所有实验数据均用x ʃs 表示，运用Image Pro
Plus ㊁GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析，组间比较采用方差分析及t 检验,P <0.05表示差异具有统计学意义㊂
2㊀结㊀果
2.1㊀琥珀酸促HUVEC 焦亡
㊀㊀为了探讨琥珀酸对血管内皮细胞焦亡的影响,
首先观察了琥珀酸的类似物DS 处理24h 后血管内皮细胞内琥珀酸含量，结果显示DS 明显增加血管内皮细胞内琥珀酸含量(图1A)㊂然后Western blot 检测了DS 对血管内皮细胞焦亡相关蛋白NLRP3㊁GSDMD-N㊁Caspase-1㊁IL-18以及IL-1β蛋白表达的影响，结果表明DS 上调NLRP3㊁GSDMD-N㊁Caspase-
1㊁IL-18以及IL-1β的表达(图1B)㊂这些结果表明细胞内琥珀酸蓄积促焦亡㊂
2.2㊀琥珀酸抑制HUVEC 的ATP 生成线粒体是细胞的能量工厂,ATP 是维持机体正
常生理活动的重要物质㊂ATP 含量检测的结果表明DS 抑制ATP 生成(图
2)㊂
图1.琥珀酸促HUVEC 焦亡(n =3)
A 为DS 促HUVEC 内琥珀酸蓄积;
B 为DS 处理HUVE
C 24h,Western blot 检测焦亡相关蛋白NLRP3㊁Caspase-1㊁GSDMD-N㊁
IL-18以及IL-1β的表达㊂a 为P <0.05,b 为P <0.01，与Control 组比较㊂
Figure 1.HUVEC pyroptosis promoted by succinate (n =
3)
图2.琥珀酸对HUVEC 线粒体ATP 生成的影响(n =3)a 为P <0.01，与Control 组比较㊂
Figure 2.Effect of succinate on mitochondrial ATP
production in HUVEC (n =3)
2.3㊀琥珀酸增加HUVEC 的ROS 水平随后，我们采用荧光探针检测琥珀酸对ROS 的
影响，结果表明DS 显著增加HUVEC 的ROS 水平
(图
3)㊂
图3.琥珀酸增加HUVEC 的ROS 水平Figure 3.Succinate promoted the generation of
ROS in HUVEC
2.4㊀ROS 清除剂NAC 抑制琥珀酸诱导的HUVEC 焦亡
为了探讨ROS 在琥珀酸诱导血管内皮细胞焦亡中的作用，我们采用ROS 清除剂NAC(2.5mmol /L)
预处理血管内皮细胞3h，再DS 孵育HUVEC，结果表明NAC 预处理抑制琥珀酸诱导的ROS 积聚(图
4A)，并且抑制琥珀酸诱导的焦亡相关蛋白表达(图
4B)㊂
图4.NAC 抑制琥珀酸诱导的HUVEC 焦亡(n =3)
A 为NAC 预处理3h 减少琥珀酸诱导的线粒体ROS 含量;
B 为NA
C 减少焦亡相关蛋白NLRP3㊁GSDMD-N㊁Caspase-1㊁
IL-18和IL-1β的含量㊂a 为P <0.05，与Control 组比较;b 为P <0.05，与DS 组比较㊂
Figure 4.NAC inhibited HUVEC pyroptosis induced by succinate (n =3)
2.5㊀琥珀酸氧化抑制剂DMM 抑制琥珀酸诱导的HUVEC 焦亡
为了进一步探讨琥珀酸促ROS 生成的机制，我
们采用琥珀酸氧化抑制剂DMM(10mmol /L)抑制琥珀酸的氧化㊂结果表明DMM 减少血管内皮细胞中ROS 的积聚(图5A)，焦亡相关蛋白NLRP3㊁GS-DMD-N㊁Caspase-1㊁IL-18以及IL-1β表达水平降低(图5B)，这些结果表明琥珀酸氧化促进ROS 的生成进而促HUVEC 焦亡㊂
3㊀讨㊀论
琥珀酸是三羧酸循环中间产物，由琥珀酰辅酶
A 合成酶催化生成㊂研究发现，琥珀酸通过非能量代谢底物途径参与多种生理和病理过程㊂琥珀酸上调
心肌细胞肥大标志物心房利钠多肽和p-Akt /t-Akt 的水平，参与右心室肥厚的形成[10]；肿瘤组织
琥珀酸/GPR91信号靶向PI3K-HIF-1α轴介导肿瘤相关巨噬细胞极化和肿瘤转移[11]㊂琥珀酸通过HIF-1α/VEGF 轴诱导类风湿关节炎滑膜血管生成[12]㊂我们的研究发现琥珀酸上调血管内皮细胞焦亡标记物的表达，提示细胞内的琥珀酸蓄积促进焦亡㊂
焦亡是一种新发现的促炎性㊁程序性细胞死亡方式，在经典的Caspase-1依赖性焦亡通路中，活化的NLRP3促前体Caspase-1成熟，进而剪切IL-18㊁IL-1β和GSDMD，介导细胞焦亡㊂Wu 等[13]发现尼古丁引起血管内皮细胞损伤并诱发焦亡；阿托伐他汀通过lncRNA NEXN-AS1/NEXN 通路抑制血管内皮细胞焦亡，以非降脂途径保护血管内皮细胞功能[14]㊂我们的结果表明，琥珀酸促血管内皮细胞焦亡，提示琥珀酸可能通过焦亡途径引起血管内皮细胞损伤以及炎症活化㊂
ROS 是细胞焦亡重要的激活分子，介导氧化低
图5.DMM抑制琥珀酸诱导的HUVEC焦亡(n=3)
A为DMM抑制琥珀酸诱导的ROS产生;B为DMM减少琥珀酸诱导的焦亡相关蛋白NLRP3㊁GSDMD-N㊁Caspase-1㊁IL-18和IL-1β的含量㊂a为P<0.05，与Control组比较;b为P<0.05，与DS组比较㊂
Figure5.DMM inhibited HUVEC pyroptosis induced by succinate(n=3)
密度脂蛋白处理的HUVEC焦亡[15]；肠道菌代谢产物氧化三甲胺通过激活ROS-TXNIP-NLRP3炎症小体轴诱导炎症和内皮功能损伤[16]㊂我们的结果表明琥珀酸类似物DS增加了血管内皮细胞ROS含量,ROS清除剂NAC可降低细胞内ROS含量并下调琥珀酸诱导的血管内皮细胞焦亡相关蛋白NLRP3㊁GSDMD-N㊁Caspase-1㊁IL-1β和IL-18的表达，表明琥珀酸通过ROS途径促血管内皮细胞焦亡㊂
细胞内ROS来源于呼吸链以及底物的氧化代谢[17]㊂Li等[18]发现DMM抑制腹膜炎小鼠肿瘤坏死因子的分泌和ROS的产生㊂在本研究中我们采用琥珀酸脱氢酶抑制剂DMM观察琥珀酸氧化代谢对ROS生成的影响，结果发现DMM明显减少ROS 的产生及焦亡相关蛋白NLRP3㊁GSDMD-N㊁Caspase-1㊁IL-1β和IL-18的表达，表明细胞内琥珀酸通过氧化途径增加ROS的生成和蓄积并促焦亡发生㊂多位学者研究发现琥珀酸脱氢酶抑制剂DMM通过抑制琥珀酸的氧化代谢改善缺血后再灌注时心㊁脑㊁肾组织损伤[19-21];Mills等[22]发现DMM抑制脂多糖诱导的IL-1β的产生，抑制炎症反应，提示通过抑制琥珀酸的氧化代谢可以抑制血管内皮细胞焦亡并保护血管内皮细胞功能㊂
综上所述，琥珀酸通过氧化代谢途径增加ROS 的生成，促血管内皮细胞焦亡，但琥珀酸在As发生㊁发展中的作用有待于进一步的探讨和验证㊂
[参考文献]
[1]李苗，王丽丽，常冰梅.血管内皮细胞功能损伤机制
的研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2019,27(8): 730-736.
[2]Martinez-Reyes I,Chandel NS.Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease[J].Nat Com-mun,2020,11(1):102.
[3]Mills E,O N eill LA.Succinate:a metabolic signal in in-flammation[J].Trends Cell Biol,2014,24(5):313-320.
[4]Tannahill GM,Curtis AM,Adamik J,et al.Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha[J].Nature,2013,496(7444):238-242.

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