黄曲霉毒素的细胞毒性及机制
徐明芳，耿梦梦
（暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 
510632）
摘 要：以正常人肝细胞（L-02细胞）为研究对象，根据细胞增殖率、活性氧（reactive oxygen species ，ROS ）含量、丙二醛（malondialdehyde ，MDA ）含量等指标的变化研究黄曲霉毒素B 1（aflatoxin B 1，AFB 1）的毒性作用及氧化应激损伤，选用VC 作为AFB 1损伤肝细胞的保护剂，通过比法测定细胞的相对存活率，从细胞周期的变化和细胞凋亡率研究AFB 1引起L-02细胞凋亡的程度及机制。结果表明：根据AFB 1的半数细胞抑制率（inhibition of cell ，IC ）（IC 50）值，选择AFB 1组的暴露质量浓度为40 μg /mL ，VC 的质量浓度选择在细胞活性最高区域的0.025～0.250 mg/mL ；当VC 质量浓度≥0.5 mg/mL 时，细胞活性与AFB 1损伤组相近；对于L-02细胞，VC 处理组及VC ＋AFB 1处理组细胞的ROS 水平较空白对照组高，但较AFB 1处理组低，表明添加VC 能够帮助L-02细胞降低胞内MDA 水平、减小拮抗氧化损伤；通过细胞凋亡及细胞周期检测，发现AFB 1造成L-02细胞中晚期凋亡的细胞所占比例较大，添加VC 能有效抑制细胞凋亡的发生；在细胞周期的检测中发现，AFB 1能够造成L-02细胞发生G 0/G 1期阻滞；添加VC 后，各细胞周期指标与空白对照组接近。
关键词：黄曲霉毒素B 1；液态乳；风险评估；人胚胎肝细胞（L-02细胞）；氧化应激
Cytotoxicity and Mechanism of Aflatoxin
XU Mingfang, GENG Mengmeng
(College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 
510632, China)
Abstract: This study investigated the cytotoxicity of aflatoxin B 1 (AFB 1) on normal human liver cell line L-02 and evaluated oxidative damage caused by AFB 1 based on changes in cell proliferation rate, reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) contents. The relative survival rate of the cells was determined by colorimetry using VC as a cytoprotectant. The extent of AFB 1-induced apoptosis in L-02 cells as well as the underlying mechanism was assessed by changes in the cell cycle and cell apoptosis rate. The results showed that the AFB 1 exposure concentration was determined as 40 μg /mL based on its half maximum inhibitory concentration (IC 50) and VC concentrations for maximum cell viability ranged from 0.025 to 0.250 mg /mL. AFB 1-induced cell damage was not attenuated at VC concentrations ≥ 
0.5 mg /mL. ROS levels in the VC and VC + AFB 1 groups were higher than in the control group but lower than in the AFB 1 group, implying that VC can help reduce the MDA level in the cells and attenuate oxidative damage. Cell apoptosis and cycle analysis showed that AFB 1 increased the percentage of apoptotic cells at the mid-late stage of apoptosis and that addition of VC inhibited the occurrence of apoptosis. Moreover, AFB 1 induced cell cycle arrest in the G 0/G 1 phase and cell cycle parameters returned to almost normal after addition of VC.
Keywords: aflatoxin B 1 (AFB 1); milk; risk assessment; normal human liver cell line L-02; oxidative stress DOI:10.15922/jki.jdst.2018.03.001
中图分类号：TS252.1                                    文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2018）03-0001-09
引文格式：
徐明芳, 耿梦梦. 黄曲霉毒素的细胞毒性及机制[J]. 乳业科学与技术, 2018, 41(3): 1-9. DOI:10.15922/jki.jdst.2018.03.001.    rykj.cbptki
XU Mingfang, GENG Mengmeng. Cytotoxicity and mechanism of aflatoxin[J]. Journal of Dairy Sc
ience and Technology, 2018, 41(3): 1-9. DOI:10.15922/jki.jdst.2018.03.001.    rykj.cbptki 收稿日期：2018-02-23
基金项目：广东省科技计划项目（2015A010107006）；暨南大学应急管理研究中心重大项目（JD2015008）第一作者简介：徐明芳（1962—），女，教授，博士，研究方向为食品质量与安全、生物反应器工程。
E-mail：xmf20142014@163
黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是一类化学结构类似的化合物，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，毒性和致癌性极强，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最为多见，其毒性和致癌性也最强。AFB1被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为Ⅰ类致癌物，具有基因毒性和细胞毒性[1]。生物体摄入AFB1后，在不同器官诱发产生细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS），破坏机体的氧化-抗氧化平衡，从而使脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）积累，对脂类、蛋白质及DNA等生物大分子造成损伤[2]。AFB1的致癌效应主要是其在Ⅰ代谢酶细胞素P450（cytochrome P450，CYP450）的作用下被活化形成活性极强又很不稳定的AFB1-8,9-环氧化物（AFB1-8,9-epoxide，AFBO）[3]，其中一部分代谢物可与细胞大分子物质，如DNA、RNA或蛋白质的多种亲核中
心发生共价结合，引起细胞错误修复受损DNA，导致严重的DNA诱变，还可抑制DNA和RNA合成，从而抑制蛋白质的合成，导致细胞生物功能受损和致癌[4-6]。另外，细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，是一种基本生命现象。
当细胞凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病；细胞凋亡过量则可能产生获得免疫缺陷综合症、重症肝炎和退行性神经疾病。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展与转化密切相关。
AFT具有很强的毒性，特别是其强致癌性，世界各国对于其污染牛乳与乳制品的情况都很重视，并对其在乳及乳制品中的含量作了严格限制。中国、日本、美国、欧盟等国家对牛乳与乳制品中的黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）含量都有着十分严格的限量标准[7-9]，但对液态乳中AFM1的污染调查与风险评估[10-11]表明，我国液态纯牛乳中AFM1的含量呈明显的地域性分布。由于南方梅雨季节是霉菌生长繁殖和产生毒素的主要条件，因此乳中AFM1的含量南方明显高于北方。如何对乳及乳制品中的AFT污染问题进行有效控制已经成为今后的研究重点以及政府和企业共同关心的问题。
本研究以具有完整的人类Ⅰ相酶、可较好反应机体对外来化学物质代谢过程和毒性作用的正常人胚胎肝细胞（L-02细胞）为研究对象，根据细胞增殖率、ROS含量、MDA含量等指标的变化研究AFB1的毒性作用及氧化应激损伤，并在前人研究的基础上，选用抗坏血酸作为AFB1损伤肝细胞的保护剂，通过比法测定细胞相对存活率，反映AFB1对细胞的抑制作用及抗坏血酸对细胞的保护作用[12-13]，再从细
胞周期变化和细胞凋亡率两方面检测AFB1引起L-02细胞凋亡的程度及机制，为乳及乳制品中AFT的污染控制提供参考，具有重要的现实意义。1 材料与方法
1.1 材料与试剂
L-02细胞来自中山大学，在广东出入境检验检疫技术中心传代保存；DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25% EDTA-胰蛋白酶美国Gibco公司；青霉素、链霉素、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，D M S O）、四甲基偶氮唑蓝（m e t h y l t h i a z o l y l t e r a z o l i u m，M T T）美国S i g m a公司；抗坏血酸（VC）广州化学试剂厂；AFB1、AFM1（纯度＞99.8%）以列Fermentek公司；细胞凋亡及细胞周期检测试剂盒美国BD公司；MDA检测试剂盒上海碧云天生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
PE全波长酶标仪美国Thermo Scientific公司；FACS CantoⅡ流式细胞仪美国BD公司；Q-B超纯水仪美国Millipore公司；MEMMERT＋INC246二氧化碳培养箱、UN55通用型烘箱德国Memmert公司；HVE-50高压灭菌锅日本Hirayama公司；SG403生物安全柜美国Baker公司；CKX41倒置相差显微镜日本Olympus 公司；CU-420电热恒温水浴槽上海一恒科学仪器有限公司；MS3MS振荡器德国IKA公司；IC1000 Countstar 自动细胞计数仪广州尚特仪器有限公司；FC-40A低速离心机广州市方统生物科技有
限公司；AEY-220电子分析天平瑞士Mettler Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 试剂配制
含10% FBS的DMEM细胞培养液：0.1 g丙酮酸钠、3.7 g NaHCO3、DMEM粉末1 包（13.4 g），共同溶于1 L超纯水中，调节pH值至7.2～7.3，0.22 μm滤膜过滤除菌，加入100 U/L青霉素和100 U/L链霉素，分装。使用培养液时，每90 mL培养基中加入10 mL FBS。4 ℃保存，含血清的培养基使用期限为2 周，未加血清的培养基使用期限为4 周。
磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：将8.0 g NaCl、3.58 g NaHPO4•12H2O、0.2 g KCl和0.24 g KH2PO4溶解于1 L超纯水中，使用高压蒸汽锅调节压力至1.1 kPa，121 ℃灭菌20 min，4 ℃保存，备用。
MTT溶液：将250 mg MTT溶解于50 mL PBS中，振荡混匀后，于室温下避光溶解24 h，用0.22 μm滤膜过滤除菌后，置于－20 ℃冰箱保存。
中性红染液：取100 μL的1%中性红，加入到150 μL 非完全培养基中，得到0.4%中性红，取200 μL的0.4%中性红加入到15.8 mL的完全培养基中，得到0.05%的中性红染液，现用现配。
AFT溶液的配制：用DMSO将AFT配制成不同浓度的待测液，4 ℃保存，备用。
1.3.2 L-02细胞培养
1.3.
2.1 L-02细胞复苏
在37 ℃水浴锅中预热含10% FBS的DMEM培养基，于紫外灯下消毒30 min后，置于超净台；从液氮罐中取出L-02细胞冻存管，于37 ℃水浴锅中快速融化；将冻存液转移至离心管中，加入2 mL培养基，吹打均匀，1 100 r/min条件下离心3 min，弃去上清液，加入3 mL培养基混匀，转移至25 cm2培养瓶中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.3.
2.2 L-02细胞传代
显微镜下观察细胞形态，该细胞为贴壁细胞，呈梭状或多边形紧密排列。吸去培养瓶中的培养基，加入1 mL 0.05%胰酶溶液，消化30 s，加入约1 mL培养基终止消化；缓慢吹打培养瓶壁至全部细胞脱落，移入离心管，1 100 r/min条件下低速离心3 min，弃去上清液；加入新鲜培养基吹打重悬，按一定比例移入25 cm2培养瓶，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
1.3.
2.3 L-02细胞冻存
吸去培养瓶中的培养基，加入1 mL 0.05%胰酶溶液，消化30 s，加入1 mL培养基终止消化；吹打培养瓶壁至全部细胞脱落，移入离心管，1 100 r/min条件下低速离心3 min，弃去上清液；按7∶2∶1（V/V）的比例将无血清DMEM培养基、FBS、DMSO配制成冻存液，将冻存液加入到离心管中重悬，分装移入冻存管，4 ℃放置30 min，－20 ℃放置1 h，－70 ℃放置3 d，液氮罐中长期保存。
1.3.3 L-02细胞倍增时间监测
新复苏传代次数较多的细胞需要进行倍增时间周期的监测。将培养至融合度为80%的第2代L-02细胞消化后接种于24孔细胞培养板，每孔接种的细胞密度为1×105个/mL（每孔100 μL）；隔天换液1 次，倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况；接种24 h后开始消化收集细胞，此后每隔24 h计数1 次，每次计数3 个孔（随机抽取），每孔计数2 次，将6 次计数的平均值作为此次的细
胞数。连续计数8 d，每隔2 d
更换1 次培养基。以培养时
间为横坐标，细胞总数为纵坐标，绘制L-02细胞的生长曲线。按照公式（1）计算细胞体倍增时间。
（1）
式中：t为细胞处于对数生长期的时间/h；N0和N1分别为对数生长期起始时和终止时的细胞数。
1.3.4 AFB1和AFM1对L-02细胞的毒性检测
1.3.4.1 细胞接种与加样
将处于对数生长期的L-02细胞消化后，离心，去上清液，加入新鲜培养基后进行细胞计数，并按1.0×106～1.3×106个/mL接种到96孔细胞培养板；放入细胞培养箱培养24 h后分组加样，阴性对照组：加入含血清培养基；溶剂对照组：加入0.32% DMSO；AFM1、AFB1受试物组：将受试物溶解于DMSO中，使DMSO终浓度小于0.1%。各组均设6 个平行孔，每孔加入量均为100 μL。继续培养24 h后，用倒置显微镜观察并记录各组细胞的形态变化。
1.3.4.2 MTT法测定细胞毒性
reactive oxygen species (ros)AFT暴露24 h后，取出96 孔板，小心吸出培养液；每孔加入100 μL培养基和20 μL MTT溶液（5 mg/mL），再放入细胞培养箱中避光孵育3 h；小心吸出孔内液体，每孔加入150 μL DMSO，放置于振荡器上低速避光振荡约10 min，使甲臜结晶溶解；用PE酶标仪在490 nm波长处测定每孔的吸光度（A
）。按照公式（2）计算细胞抑制率（inhibition of cell，IC）。
（2）
式中：A1为受试组吸光度；A2为对照组吸光度。1.3.5 VC对L-02细胞的毒性检测
细胞接种与加样同1.3.4节。VC用完全培养基配制，浓度设置参考SN/T 2328—2009《化妆品急性毒性的角质细胞试验》[14]。
中性红法检测细胞毒性：VC暴露24 h后，取出96孔板，小心吸出培养液；每孔加入100 μL 0.05%中性红溶液，再放入细胞培养箱中避光孵育3 h；将冰醋酸、乙醇、水按照体积比1∶50∶49的比例配制成提取液，每孔加入150 μL提取液，于振荡器上低速避光振荡约10 min；用PE酶标仪在540 nm波长处测定每孔的吸光度（A），计算IC。
1.3.6 VC对AFB1处理L-02细胞的保护
将处于对数生长期的L-02细胞消化后，离心，去上清液，加入新鲜培养基后进行细胞计数，并按1.0×106～1.3×106个/mL接种到96孔细胞培养板；放入细胞培养箱培养24 h后分组加样，阴性对照组：加入含血清培养基；受试物组：40 μg/mL AFB1处理组加入VC 的质量浓度分别为1.000、0.750、0.500、0.250、0.100、0.075、0.050、0.025、0 mg/mL，每个质量浓度设6 个平行孔，加入量均为100 μL；继续培养24 h后，用倒置显微镜观察并记录各组细胞的形态变化。
中性红法测定细胞毒性的方法同1.3.5节。
1.3.7 VC干预下AFB1作用于L-02细胞的MDA生成量检测
细胞接种与加样：将处于对数生长期的L-02细胞消化后，离心，去上清液，加入新鲜培养基重悬，进行细胞计数，并按5.0×105～6.0×105个/mL接种到24孔细胞培养板，每孔500 μL；放入细胞培养箱培养24 h后分
组加样。阴性对照组：加入含血清培养基；阳性对照组：加入0.003% H 2O 2；受试物组：加入40 μg /mL AFB 1（不加VC ）以及40 μg /mL AFB 1处理组加入VC ，加入VC 的质量浓度分别为0.250、0.100、0.075、0.050、 0.025 mg/mL ，每个质量浓度设3 个平行孔，加入量均为600 μL ；继续培养24 h 后，用倒置显微镜观察并记录各组细胞的形态变化。
MDA 含量测定：取出培养板，吸去孔内样液，每孔用500 μL PBS 轻轻清洗2 次，随后用Westen 裂解液裂解细胞10 min ，取每孔上清液于EP 管中做好标记， 1 600 r/min 、4 ℃条件下离心5 min ，取上清液；按照MDA 试剂盒说明书步骤，取标准品200 μL ，将其由1 000 μmol /mL 稀释为500、200、100、50、20、 10 μmol /mL ，绘制标准曲线，再依次加入所需试剂，在532 nm 波长处测定光密度（optical density ，OD ）。1.3.8 VC 干预下AFB 1作用于L-02细胞的ROS 含量检测
ROS 水平通过荧光探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate ，DCFH-DA ）法测定。DCFH-DA 穿过细胞膜后，通过酶促反应水解形成非荧光性的DCFH ，后者在ROS 的存在下被迅速氧化成具有荧光的双氯荧光素（diclofluorescein ，DCF ），DCF 的荧光强度与细胞内的ROS 含量成正比。
细胞接种与加样同1.3.7节。将VC 质量浓度调整为 0.1 mg/mL ，加样量为300 μL 。
7氨基放线菌素D （7 aminoactinomycin D ，7AAD ）染：向20 μL 7AAD 中加入80 μL PBS ，配制成染液，每管加入100 μL ，避光染10 min ，取出用PBS 清洗2 次。
取出细胞培养板，吸去孔内样液，PBS 轻轻清洗2 次消化细胞，并转入EP 管做标记，37 ℃、1 300 r/min 条件下离心3 min ，去上清液，PBS 清洗2 次，离心后取沉淀；配制0.15 μg /mL 的DCFH-DA 溶液，每个EP 管中加入1 mL ，在37 ℃培养箱中孵育20 min ；结束后用PBS 清洗2 次。荧光强度用流式
细胞仪检测，激发波长480 nm ，发射波长
530 nm 。ROS 的相对含量按照公式（3）计算。
（3）
1.3.9
细胞周期检测
细胞在接受受试物的暴露后会产生损伤，多表现为细胞周期的停滞，碘化丙啶（propidium iodide ，PI ）在一定波长下会发出荧光，其强度与DNA 含量成正比，可以标记细胞核，显示细胞核状态，从而判定细胞所在周期。
调整对数期细胞密度为5×105 个/mL ，每孔1 mL ，
接种于12孔板中孵育24 h 后，弃去培养基，加入含有AFB1的培养基继续培养24 h ；24 h 后将12孔板中的细胞培养液转移至离心管，用胰酶消化细胞1 min 后加入前面收集的细胞培养液终止反应；收集吹打
下的细胞到离心管内，1 200 r/min 离心5 min 后小心除去上清液；加入约1 mL 冰浴预冷的PBS 重悬细胞，并转移到EP 管内，离心（1 200 r/min ，5 min ）后弃去上清液；加入预冷的PBS 重悬细胞，分装至离心管中；1 200 r/min 离心5 min ，弃去上清，加入1 mL 预冷的Buffer 重悬，1 200 r/min 离心5 min ，重复操作3 次，用细胞计数器调整细胞密度至1×106 个/mL ，1 200 r/min 、室温条件下离心5 min ，弃去上清液，按照细胞周期试剂盒操作步骤固定、染后上流式细胞仪进行检测。结果用ModfitLT 3.2软件分析。1.3.10
细胞凋亡率检测
L-02细胞接受AFB1暴露后，如果细胞自我修复能力不足，又无外界抗氧化物质的辅助修复，细胞周期将停滞不前，细胞凋亡随即启动，最终进入不可逆的晚期凋亡。采用膜联蛋白V （Annexin V ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate ，FITC ）/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。晚期凋亡中，细胞的细胞膜上磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine ，PS ）蛋白外翻，Annexin V-FITC 抗体能与之特异性结合，表明细胞启动凋亡，细胞膜开始崩解。PI 则用于细胞核染，当细胞膜破裂后，PI 得以进入细胞内，对细胞核进行染。Annexin V-FITC 阴性和PI 阴性的细胞即为活细胞，Annexin V-FITC 阳性而PI 阴性则为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC 阳性且PI 阳性的细胞为凋亡细胞，Annexin V-FITC 阴性但PI 阳性则为实验操作过程中损伤的细胞，导致细胞核逸出，该种情况较为少见[15]。
细胞铺板和添加受试物操作同1.3.9节，收集吹打下的细胞到离心管内，1 200 r/min 离心5 min 后小心除去上清液；加入约1 mL 冰浴预冷的PBS 重悬细胞，并转移到EP 管内，离心（1 200 r/min ，5 min ）后弃去上清液；加入预冷的PBS 重悬细胞，分装至离心管中； 1 200 r/min 离心5 min ，弃去上清液，加入1 mL 预冷的Binding Buffer 重悬，调整细胞密度至1×106 个/mL ，取100 µL 至流式管，加入5 µL FITC 和5 µL PI ，避光染15 min ，再加入400 µL 的Binding Buffer ，混匀，上流式细胞仪进行检测。1.4
数据处理
每组实验平行测定3 次，实验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 13.0软件中的单因素方差分析和t -检验对数据进行分析。
2
结果与分析
2.1 L-02细胞形态观察
a
b
a. 40×；
b. 100×。
图 1
倒置相差显微镜下L-02细胞（第7代）的形态
Fig. 1
Morphology L-02 cells (7th
generation) under inverted phase
contrast microscope
由图1a 可知，正常生长状态下，第7代L-02细胞密度
适中，整体分散均匀，部分集中生长，表明细胞处于分裂期，无过多碎片及杂质或较大细胞团。由图1b 可知，细胞主要呈多角型，有明显突起并贴壁舒展，如观察到细胞形态变化异常或脱落，则应更换细胞，方可继续后续实验。
2.2 L-02细胞的倍增时间
图 2
L-02细胞的倍增曲线
Fig. 2
Proliferation curves of L-02 cells
正常情况下L-02细胞的倍增时间约为20 h ，波动时间18～33 h 。由图2可知，采用的L-02细胞的平均倍增时间为29.19 h ，符合L-02细胞的正常生长周期。一般细胞需控制在30 代以内进行传代，30 代以上的细胞不能用于实验。本研究采用的L-02细胞从复苏到实验控制在20 代以内，传代周期为2 d 。
2.3 AFM 1和AFB 1对L-02细胞的毒性
取适量的AFM 1和AFB 1标准储备液，用DMSO 稀释，配制成所需要的系列质量浓度待测液，作为L-02细胞的
受试物，作用24 h 后进行MTT 实验[14]
。
由表1可知，AFB 1和AFM 1对L-02细胞活性的抑制均表现出质量浓度依赖性。用最高质量浓度AFM 1处理L -02细胞24 h 后，与对照组相比，细胞活性降低至（74.68±1.68）%（P ＜0.05）；溶剂对照组（0.32% DMSO 组）与AFB 1、AFM 1和空白对照组间的差异均不具有统计学意义（P ＞0.05）；在相同的处理时间内，质量浓度最高的AFB 1使细胞活性显著降低至
（36.53±0.78）%；溶剂对照组，2.5、5.0 μg /mL AFB 1组与空白对照组间无显著差异（P ＞0.05），10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 μg /mL AFB 1组的细胞活性均低
于空白对照组（P ＜0.05），随着AFB 1质量浓度的逐渐增大，L-02细胞的活性逐渐降低。
表 1 不同质量浓度AFB 1和AFM 1暴露24 h后L-02细胞的活性
Table 1
Cell viability of L-02 cells exposed to different concentrations
of AFB 1 and AFM 1 for 24 h
组别添加量细胞活性/%空白对照组0100.00±5.42DMSO 组
0.32%95.76±4.78AFB 1组
2.5 μg /mL 97.88±9.975.0 μg /mL 89.28±12.1010.0 μg /mL
70.62±5.70*20.0 μg /mL 50.31±4.88*40.0 μg /mL 44.41±1.84*80.0 μg /mL 38.62±7.46*160.0 μg /mL 35.96±1.68*320.0 μg /mL 36.53±0.78*AFM 1组
5.0 μg /mL 97.10±8.6710.0 μg /mL 88.28±8.1320.0 μg /mL
85.52±3.7240.0 μg /mL 80.53±5.48*80.0 μg /mL 79.21
±1.84*160.0 μg /mL 79.32±2.86*320.0 μg /mL
74.68±1.68*
注：*. 与空白对照组相比，差异显著（P ＜0.05）
。表5～6同。图 3
AFM 1和AFB 1处理L-02细胞24 h的剂量-效应曲线
Fig. 3
Concentration-response curves of AFM 1 and AFB 1 exposure for
24 h in L-02 cells
由图3可知，利用剂量-效应曲线计算出细胞活性为50%时的AFB 1质量浓度为38.72 μg /mL ，而在AFM 1短时间暴露中未造成细胞明显死亡。由于质量浓度及毒性强度的限制，在后续实验中采用40 μg /mL 的AFB 1进行进一步研究。
2.4 VC 对L-02细胞的毒性
由表2可知，VC 的质量浓度为1.0×10－1、1.0×10－2、 1.0×10－3、1.0×10－4、1.0×10－5 mg/mL 时，细胞活性之间均无显著差异（P ＞0.05），且均高于空白对照组的细胞活性。当VC 质量浓度为1.0～1.0×102 mg/mL 时，随着VC 质量浓度的增大，L-02细胞的活性下降。

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