内质网应激相关活性氧及其机制
作者：孙晶 王巍 田野 田振
来源：《中国医药导报》2018年第16期
        [摘要] 内质网（ER）是细胞内的一个精细的膜系统，交织分布于细胞质中，主要负责蛋白合成、修饰、加工及新生肽链的折叠、运输等。改变ER的氧化环境及其内Ca2+含量会导致内质网应激（ERS）诱导的活性氧（ROS）的产生。其中，蛋白质二硫键异构酶、内质网氧化还原酶、谷胱甘肽/谷胱甘肽脱水酶、NADPH氧化酶4、细胞素P450酶、Ca2+及线粒体呼吸链蛋白发挥着重要的作用。本文回顾了持续的ERS和蛋白质错误折叠引发的ROS级联及其相关机制。
        [关键词] 内质网应激；活性氧；机制
        [中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（a）-0042-04
        [Abstract] Endoplasmic reticulum（ER） is the major site of calcium storage and protein folding. Alterations in the oxidative environment of ER and also intra-ER Ca2+ can cause the
production of ERS-induced ROS. PDI， ERO-1， GSH， Nox4， CYP， Ca2+ and mitochondrial electron transport chain proteins play crucial roles in ERS-induced production of ROS. Here， persistent ERS and protein misfolding-initiated ROS cascades and their related mechanisms will be reviewed.
        [Key words] Endoplasmic reticulum stress； Reactive oxygen species； Mechanism
        内质网（endoplasmic reticulum，ER）是所有真核细胞分泌途径的主要细胞器，在细胞中执行多种多样的功能，包括蛋白质生物合成、折叠、易位和翻译后修饰（包括糖基化、二硫键形成等）[1]。不同的蛋白质完成正确折叠和组装的时间不同，在指定时间内不能正确折叠的蛋白质会通过泛素-蛋白酶体系进行ER相关降解（ER-associated degradation，ERAD）[2]。许多分子伴侣和酶通过ERAD共同作用来限制ER工作量以促进蛋白质折叠并阻止其聚集[3]。当ER工作量过多时，蛋白质不能达到其天然折叠状态，导致未折叠蛋白质在ER腔中聚集，这种情况称为ER应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），它会扰乱细胞的内环境稳态。ERS发生后，细胞会启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）以恢复细胞的内环境稳态[4]。在长期严重的ERS下，UPR不再发挥细胞保护作用，而
开始产生细胞毒性作用（包括凋亡）。许多证据表明，活性氧（ROS）的产生与ERS之间存在直接联系[5-6]。UPR期间介导ROS生成的主要酶组分是蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）、内质网氧化还原酶（endoplasmic reticulum oxidoreductin-1，ERO-1）和NADPH氧化酶复合物（特别是Nox4）。此外，线粒体电子转运酶也会诱导ROS的产生[7]。本文将阐述持续的ERS和蛋白质错误折叠，引发ROS级联反应及其相关机制。
        1 二硫键形成过程中ERS诱导ROS产生
        PDI是ER中必不可少的二硫键形成酶。它是细胞中最丰富的蛋白质之一，存在于动物、植物和真菌中。PDI和ERO-1驱动ER中蛋白质二硫键的形成。ERO-1借助黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）依赖性反应将电子从PDI经历几种硫醇-二硫化物交换反应转移到分子氧（O2），氧的不完全还原导致超氧阴离子自由基的形成，其可以转化为过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）或其他ROS，引起ER中蛋白折叠诱发的氧化应激。该电子转移表明ERO-1可以促进ER内的ROS形成，涉及ERO-1的二硫键形成过程对细胞中ROS的总产量有显著贡献。如上所述，ERO-1与ER中的蛋白质折叠具有很强的相关性，并且可以触发ROS产生、促成ERS。
        2 Nox4介导的ERS诱导ROS产生
        在众多生成ROS的途径中，NADPH氧化酶发挥着主要的作用。NADPH氧化酶是具有7个成员的蛋白质家族，包括Nox 1-5和Duox 1和2[8]，其中与ER最具有相关性的亚型是Nox4。除ER外，线粒体、细胞核和细胞骨架等其他位置也存在Nox4。Nox4也涉及ERS诱导的ROS生成。研究表明，与p22phox亚基相关的Nox4使用NADH或NADPH（作为电子供体）来进行氧还原产生超氧阴离子[9]。在由氧合脂质产物7-酮胆固醇或衣霉素引起的ERS状态下，人血管平滑肌细胞中诱导Nox4表达增多，ROS的产生也随之增加[10]。而沉默Nox4可以减少UPR诱导的细胞ROS的产生，并且还负责促凋亡和促适应信号，即伴侣的表达[11]。此外，在ERS相关疾病方面，已有研究阐述了在各种ERS诱导的疾病状况下Nox4在ROS生产中的作用[12-13]。
        3 CYP诱导ROS产生
        细胞素P450酶（cytochrome P450 enzymes，CYP）是单加氧酶的一个超级家族，被认为是氧化应激的标志物，多数负责异生素的解毒反应。CYP是ER中电子传输链的一部分，其构成一系列含血红素的酶，在许多内源性和外源性化合物的氧化代谢中发挥重要的作
用[14]。异生物质侵入时，其代谢过程中CYP对有毒化合物的反应会是ROS的一个重要来源。遇到底物时，CYP与一分子氧相结合后连接到目标化合物上形成氧复合物。氧复合物通过中间反应被还原成过氧化合物，接受两个质子并产生水，其过程中超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等可能导致细胞损伤的代谢物会被CYP转化为ROS。CYP通过与其氧化还原伴侣NADPH-细胞素P450还原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase，NPR）以摩尔比为1∶1的形式相互作用来催化这些反应[15]。在底物代谢过程中，电子从NADPH转移到细胞素P450还原酶（cytochrome P450 reductase，CPR），然后由CPR转移到CYP[16]。从NADPH到CYP的电子转移的效率或程度低至0.5%～3.0%。NPR和真核CYP之间发生氧化还原循环时所引起的“电子泄漏”在ROS生成中起重要作用。
        4 ERS条件下线粒体相关ROS的产生
        ERS期间，ER和线粒体可以通过以下方法或因素相互作用。第一个因素是位置，即线粒体和ER之间的紧密靠近，引起两个细胞器之间物理性的直接相互作用[17]；第二个因素是Ca2+的变化，影响线粒体膜电位三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）消耗和ROS形成[18]；第三个因素是特殊的诱导信号的表达，如Lon蛋白酶，其通过干扰细胞素c氧化
酶复合物装配/降解来保护线粒体，并且类似地，诱导NIX（调节ER的Ca2+和线粒体膜电位的Bcl-2家族蛋白）表达并开放线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP）[19]。因此，由ERS信号引发的ER腔中的氧化应激的爆发作用于线粒体，以进一步增强ROS的产生，以增加胞质Ca2+或消耗ATP的方式，引发线粒体内的氧化磷酸化，使ROS产生最大化。
        4.1 GSH在ERS诱导线粒体ROS产生中的作用
        已有研究证明GSH在维持ER氧化还原酶的还原状态中起核心作用[20]，其氧化形式及还原形式之间的比例是氧化还原环境的指示器[21]。在二硫键形成过程中，ERO-1被O2氧化，产生H2O2及副产物氧化型GSH。两者都导致ER腔内氧化还原状态紊乱，进而引起氧化应激后的ERS[22-23]。GSH的消耗（通过ERS期间的二硫键还原）可使线粒体产生ROS，导致细胞死亡[24]。线粒体相关ROS可能进一步增强ERS反应，从而增加线粒体ROS积聚，这是提示严重/持续性ERS相关性ROS和线粒体功能障碍的潜在信号机制。因此，哺乳动物和酵母细胞适应应激状态并增加GSH的合成以降低ROS水平来保持氧化还原衡。
        4.2 reactive oxygen species (ros)线粒体呼吸链系统在ERS诱导线粒体ROS产生中的作用
        线粒体在ERS介导ROS产生中发挥作用，干扰线粒体呼吸链可以显著降低UPR诱导的ROS累积[25]。已有报道表明Ca2+诱导一氧化氮合酶生成一氧化氮（NO），抑制线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性，进一步增强线粒体呼吸链复合物Ⅲ中Qo位点的ROS生成[26]。此外，NO及高水平Ca2+可以抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ，诱导MPTP的开放并阻断复合物Ⅲ、释放细胞素c，从而增加ROS的产生。
        5 ERS条件下Ca2+相关ROS的产生
        Ca2+的释放/迁移是与ERS条件高度相关的。ERS的早期阶段，ROS水平升高导致的氧化应激引起Ca2+通过膜连接通道从细胞外基质流入细胞质或通过ER/肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）定位的通道从ER/SR进入胞质。细胞质中Ca2+浓度的增加促进Ca2+进入细胞核和线粒体。线粒体Ca2+增加可促进线粒体三羧酸循环和氧化磷酸化，刺激其代谢进而增加ROS的产生。ROS可进一步作为ER的反馈信号，增强Ca2+释放通道的敏感性，进而增加Ca2+从ER释放的可能性[27]。此外，ER和线粒体之间物理性相互作用同样会导致从ER释放的Ca2+进入线粒体，引起上述反应。当线粒体基质内的Ca2+返回到ER时正向反馈环会衰减。因此，ER/线粒体Ca2+循环对ERS介导ROS产生具有重要意义。
        尽管在ER和细胞质中均发生未折叠蛋白质聚集，但在ERS条件下，ROS相关的小蛋白质聚集体比较大的蛋白质聚集体更有害，因为它们结合TATA结合蛋白和cAMP反应元件结合蛋白并损害泛素-蛋白酶途径。相反，较大的蛋白质聚集体和分子伴侣，如TRiC和HSP70，通过进一步抑制聚集体形成而在细胞中起保护作用。由年龄、突变、特异性或环境因素等因素引起的ERS的失败可能导致不同的疾病。原理上，氧化蛋白的聚集取决于氧化还原信号传导介质、抗氧化剂、促氧化剂和蛋白水解活性的平衡，最终提供构象疾病的分子机制。

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