2021年2月电工技术学报Vol.36  No. 4 第36卷第4期TRANSACTIONS OF CHINA ELECTROTECHNICAL SOCIETY Feb.    2021
DOI: 10.19595/s.201227
Ar等离子体射流处理乙醇水溶液的
放电特性及灭菌效应
夏文杰1,2刘定新2
（1. 省部共建电工装备可靠性与智能化国家重点实验室（河北工业大学）天津  300130
2. 西安交通大学等离子体生物医学研究中心西安  710049）
摘要乙醇是一种医疗上常用的消毒剂，理论上在Ar等离子体射流处理的水溶液中掺杂乙醇可以增强灭菌效果。通过对耐甲氧西林金黄葡萄球菌的灭活实验，发现在被处理的水溶液中掺杂20%乙醇可使Ar射流等离子体活化水的灭菌效果提高5个数量级以上。进一步地，发现当工作气体中掺杂0.2%N2或在屏蔽罩中掺杂1%O2时，只需在被处理的水溶液中掺杂2%乙醇，即可提高5个数量级以上的灭菌效果。同时发现，2%乙醇掺杂可使等离子体中多个放电通道交叠，原因可能是亚稳态Ar*和乙醇气体分子在气液界面的彭宁电离
作用。最后，通过对液相活性粒子的检测分析，发现等离子体活化乙醇溶液中的过氧乙酸可能在灭菌过程中起主导作用，而过氧亚硝酸和过氧乙酸可能协同作用增强了灭菌效果。
关键词：Ar等离子体射流乙醇放电特性灭菌效应
中图分类号：TM89
Discharge Characteristics and Bactericidal Effect of
Ar Plasma Jet Treating Ethanol Aqueous Solution
Xia Wenjie1,2  Liu Dingxin2
（1. State Key Lab of Reliability and Intelligence of Electrical Equipment
Hebei University of Technology  Tianjin  300130  China
2. Centre for Plasma Biomedicine  Xi’an Jiaotong University  Xi’an  710049  China）
Abstract  Ethanol is a kind of commonly used disinfectant in medical treatment. Theoretically, doping ethanol into aqueous solution treated by Ar plasma jet can enhance the bactericidal effect.
Through the inactivation experiment of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, it was found that the bactericidal effect of Ar jet plasma-activated water was increased by more than 5 orders of magnitude by doping 20% ethanol. Furthermore, when 0.2% N2 was mixed into the working gas or 1% O2 was added into the shield, the bactericidal effect can be improved by more than 5 orders of magnitude by doping 2% ethanol. At the same time, 2% ethanol doping can cause the overlapping of multiple discharge channels in the plasma, which may be due to Penning ionization of metastable Ar* and ethanol gas molecules at the gas-liquid interface. Finally, the analysis of reactive species in liquid phase show that peracetic acid in ethanol solution activated by plasma may play a leading role in the sterilization process, and peroxynitrite and peracetic acid may synergistically enhance the bactericidal effect.
Keywords：Ar plasma jet, ethanol, discharge characteristics, bactericidal effect
收稿日期 2020-09-17  改稿日期 2020-10-10
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0引言
近年来，大气压等离子体射流由于可以直接将等离子体中的短寿命活性粒子和带电粒子作用于生命体并诱导生物医学效应，在癌症、伤口愈合、消毒与灭菌等领域的研究和应用得到了快速发展[1-5]。在这些应用中，被处理的生物物质往往处于潮湿或液体环境中，使得等离子体与水溶液的相互作用不可避免[6-7]。同时，国内外学者发现等离子体产生的紫外辐射、局部热场、强电场、带电粒子以及活性粒子等可通过改变细胞所处液相环境（主要是液相活性粒子的改变）而产生生物医学效应[2]。一般认为，等离子体与水溶液相互作用产生的活性氧粒子（Reactive Oxygen Species, ROS）和活性氮粒子（Reactive Nitrogen Species, RNS）在生物医学效应中起着最关键作用[8-10]。这些ROS和RNS可分为长寿命活性粒子，如过氧化氢（H2O2）、臭氧（O3）、硝酸（HNO3/NO3−）、亚硝酸（HNO2/NO2−）等，以及短寿命活性粒子，如羟基（·OH）、超氧阴离子（O2·−/HOO·）、过氧亚硝酸（ONOOH/·ONOO−）、过氧硝酸（O2NOOH/O2NOO−）等[11-17]。
然而，等离子体射流由于放电功率和处理面积较小，在较短时间内与水溶液相互作用产生的液相ROS和RNS浓度往往较低。在一些对化学活性要求较高的生物医学应用中，如微生物灭活，等离子体射流很难在短时间内达到理想的处理效果，尤其是对水溶液中多重耐药微生物的灭活。例如：Ma Ruonan等采用Ar+2%O2等离子体射流处理去离子水10min，再用生成的等离子体活化水处理金黄葡萄球菌15min，发现只能使其细菌菌落数（Colony- Forming Unit, CFU）降低  1.9个数量级[18]；Xu Yingyin等采用Ar+2%O2等离子体射流处理去离子水20min，再用等离子体活化水处理好氧嗜常温菌5min，发现只能取
得0.22个数量级的灭菌效果[19]；Xia Wenjie等分别采用Ar和Ar+0.08%O2等离子体射流处理耐甲氧西林金黄葡萄球菌（Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus, MRSA）悬液5min，发现都没有灭菌效果[20]。因此，如何提升等离子体射流与水溶液相互作用产生的液相ROS和RNS的成分和浓度，以增强生物医学应用效果，是等离子体射流在生物医学领域应用和发展的关键问题。
值得注意的是，乙醇是一种医疗上常用的消毒剂，但是高浓度的乙醇对伤口具有强烈的刺激性，而低浓度的乙醇对耐药微生物的灭活效果较差。理论上，等离子射流与乙醇溶液相互作用可以产生协同灭菌效应。同时，相比于价格昂贵的氦气，氩气（Ar）是一种较为便宜的稀有气体[21-23]。因此，在
工业大规模应用中，Ar常作为工作气体来产生等离
子体[24-26]。本文针对Ar等离子体射流处理水溶液，研究了被处理的水溶液中少量乙醇掺杂对放电特性和灭菌效应的影响。首先，对比了放电和不放电两种情况下Ar射流等离子体活化乙醇溶液（Plasma- activated Ethanol Solution, PAES）和乙醇溶液对MRSA的灭活效果。为了增强PAES的灭菌效果，同时降低乙醇对伤口的刺激性，进一步研究了低乙醇浓度下工作气体中不同O2或N2掺杂浓度对灭菌效果的影响。通过放电特性和发射光谱分析，提出在屏蔽罩中通入Ar+O2以优化PAES灭菌效果的方法。最后，通过液相活性粒子检测分析，阐述PAES 的灭菌机理。
1实验装置与方法
图1展示了Ar等离子体射流处理乙醇溶液以及PAES用于灭菌处理的实验装置。等离子体射流
源采用针−环电极结构，高压电极采用石英帽包裹的钨针电极，与高压纳秒脉冲电源相连；环形接地电极则由10mm宽的铜箔包裹在石英管外构成，位
于气流下游端。高压针电极与环形接地电极、环形接地电极与石英管管口的间距都为5mm。石英管的
内径为4.0mm，外径为6.0mm。工作气体通路包含Ar、O2和N2三条气体支路。通过质量流量控制器
分别产生Ar、Ar+O2混合气体和Ar+N2混合气体三种工作气体，并通入等离子体射流源中，总气体流量都为5L/min。其中，O2或N2掺杂比控制为0.08%、0.2%、0.5%、1%。为了保证Ar等离子体射流能作
用到乙醇溶液的液面，高压纳秒脉冲电源的电压幅值选定为8.0kV，频率选定为23kHz，脉宽选定为6.0μs。待处理的乙醇溶液（体积为1.0mL）置于直
径为15mm的石英圆皿中，液面和石英管管口的间
距为15mm。
在实验测量中，采用高压电压探头Tektronix P6015A和电流探头Pearson 2877分别测量电压幅
值和流经地电极的电流。通过泰克示波器Tektronix MDO3054（带宽为500MHz，采样频率为2.5GS/s）对电压和电流波形进行采集。放电图像由数码相机Nikon D7000拍摄，曝光时间为1.0s。等离子体时
空演化过程的图像由型号为PI-MAX3的增强型电荷耦合装置（Intensified Charge-Coupled Device,
第36卷第4期夏文杰等Ar等离子体射流处理乙醇水溶液的放电特性及灭菌效应 767
图1  Ar等离子体射流处理乙醇溶液及PAES灭菌装置Fig.1 The device of ethanol solution treated by
Ar plasma jet and PAES used for sterilization ICCD）相机拍摄，曝光时间为20ns。同时，采用型号为SR750的Andor光学发射光谱仪对石英管管口处的辐射激发态粒子进行检测，发射光谱检测范围为300～800nm，分辨率0.015nm。此外，采用型号为SQD2的Waters H-Class UPLC液相谱-质谱联用仪和型号为EXM+的Bruker电子自旋共振波谱仪对等离子体活化乙醇溶液中的活性粒子进行检测。实验中采用捕捉剂TEMPONE-H与等离子体活化乙醇溶液中的·ONOO−/O2·−反应生成自旋加合物TEMPONE·。自旋加合物谱线通过电子自旋共振波谱仪测得，并通过SpinFit软件进行拟合排除噪声干扰，再通过双积分值与自由基浓度的线性关系换算得到样品中加合物的浓度。浓度换算的线性关系采用TEMPONE˙标准曲线的换算公式。
在PAES灭菌实验中，采用微生物灭活实验中常用的耐甲氧西林金黄葡萄球菌作为研究对象，实验重复3次。具体过程如下：
（1）MRSA悬液制备。首先，将MRSA在4mL 的胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone Soybean Broth, TSB）液体培养基中37℃过夜培养。然后，将300μL 培养液转移到30mL的TSB液体培养基中进一步37℃培养3h，再以4 000r/min的速度离心2min，接着在生理盐水溶液中重悬MRSA。通过紫外-可见分光光度计检测MRSA悬浮液的吸光度，也即光密度（Optical Density, OD）。其在波长λmax= 600nm处有最大吸收强度，从而制备OD600=1的MRSA悬液，其浓度约为1×109CFU·mL−1。
（2）PAES灭活MRSA。首先，在等离子体射流活化1mL乙醇溶液5min后，立即搅拌石英皿中的PAES 5s。然后，用移液将450μL的PAES转
移到含有50μL MRSA悬液的离心管中，孵化5min。
（3）细菌存活菌落数统计。采用10倍梯度稀释
法在磷酸缓冲盐溶液中对处理后的MRSA悬液（5× 107CFU·mL−1）进行稀释，然后在TSB琼脂板上进
行涂布，每个稀释浓度取3个10μL的样品，培养24h 后统计细菌菌落数即可计算出每毫升处理后的细菌
悬浮液中存活的细菌菌落总数。
2灭菌效果的对比分析
2.1放电与不放电两种情况下灭菌效果的对比
图2展示了放电和不放电两种情况下PAES和乙醇溶液对MRSA的灭活效果。结果表明，不放电时40%以上的乙醇溶液可以取得5个数量级以上显著的灭菌效果（***p＜0.001）；但低于20%的乙醇溶液
对MRSA的灭活效果可以忽略不计，相较于对照组无明显统计学差异。而放电时PAES的灭菌效果随着
乙醇浓度的增加逐渐增强；当乙醇浓度为5%时，PAES的灭菌效果相较于对照组显著增加（***p＜0.001）；当乙醇浓度为20%时，PAES灭活MRSA
可使其CFU降低5个数量级以上，即培养基上的细菌菌落数从5×107CFU·mL−1降低到检测域限（1×  102CFU·mL−1）。进一步地，发现当乙醇浓度为5%～20%时，放电情况下PAES的灭菌效果相较于不放
电情况下乙醇溶液的灭菌效果显著增加（&&p＜0.01，&&&p＜0.001）。以上分析结果表明，Ar等
离子体射流和乙醇溶液确实具有协同灭菌效应。
图2  放电和不放电两种情况下PAES和乙醇溶液对
MRSA的灭活效果
Fig.2 Inactivation effect of PAES and ethanol solution on MRSA with and without discharge
2.2Ar中掺杂O2/N2的灭菌效果分析
由于20%乙醇对于伤口的刺激性仍较大，为了
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降低乙醇对伤口的刺激性，同时增强PAES的灭菌效果，本小节进一步研究了工作气体中不同O2或N2掺杂浓度对灭菌效果的影响。
工作气体Ar中不同O2或N2掺杂浓度下PAES 对MRSA的灭活效果如图3所示。当工作气体Ar 中掺杂O2后，PAES反而失去对MRSA的灭活效果，如图3a所示。原因可能是电负性氧气大量吸附等离子体中的电子，从而影响等离子体射流与乙醇溶液的相互作用。当工作气体Ar中掺杂N2时，PAES 的灭菌效果随着乙醇浓度的增加逐渐增强，随着N2浓度的增加先增强后减弱，如图3b所示。其中，当N2掺杂浓度为0.2%时，PAES的灭菌效果最佳，此时在2%乙醇浓度条件下就能实现5个数量级以上灭菌效果的增强。
原因可能是少量的N2掺杂可以促进RNS的产生，而较高浓度的N2掺杂使得电子与N2的碰撞电离加剧，对放电特性产生较大影响，从
（a）Ar+O2等离子体射流
（b）Ar+N2等离子体射流
图3  工作气体Ar中不同O2或N2掺杂浓度下PAES对
MRSA的灭活效果
Fig.3 Inactivation effect of PAES on MRSA under different O2 or N2 doping concentrations in Ar 而影响等离子体射流与水溶液的相互作用。
3放电特性及发射光谱的分析
3.1电压电流特性的分析
图4展示了Ar等离子体射流处理2%乙醇溶液的电压电流波形。在电压波形上升沿和下降沿处，电流波形的放大图像为多条抖动的曲线（此处用三条曲线进行示意）。这表明即使在纳秒脉冲电压的激励下，Ar等离子体射流的电流波形仍不稳定，即Ar等离子体射流仍处于丝状放电模式。随着工作气体Ar中O2掺杂浓度的增加（0～1%），电流波形变得更加不稳定，这说明O2的掺杂不利于Ar等离子体射流的弥散化。随着工作气体Ar中N2掺杂浓度的增加（0～1%），电流波形仍不稳定（由于掺杂O2或N2后Ar等离子体射流的电流波形都不稳定，且和图4相似，没有给出它们的电压电流波形）。
图4  Ar等离子体射流处理2%乙醇溶液的电压电流波形Fig.4  Voltage and current waveforms of 2% etha
nol
solution treated by Ar plasma jet
3.2放电图像的分析
图5展示了工作气体Ar中不同O2或N2掺杂浓度下等离子体射流处理2%乙醇溶液的放电图像。随着工作气体Ar中O2掺杂浓度的逐渐增加（0～1%），Ar+O2等离子体羽流的长度逐渐变短。甚至当O2掺杂浓度为1%时，等离子体羽流不能喷出石英管的管口。而随着工作气体Ar中N2掺杂浓度的逐渐增加（0～1%），Ar+N2等离子体羽流的形态没有发生明显改变，且都能作用于乙醇溶液。原因是电负性的O2具有较高的电子亲和势（0.45eV），吸附了大量电子，从而阻碍了等离子体羽流向前传播，导致等离子体羽流长度变短。而掺杂O2和N2后等离子羽流长度的差异可能导致PAES灭菌效果的不同。
3.3等离子体时空演化特性的分析
为了研究Ar+O2/N2等离子体射流与乙醇溶液
第36卷第4期夏文杰等Ar等离子体射流处理乙醇水溶液的放电特性及灭菌效应 769
（a）Ar+O2等离子体射流
（b）Ar+N2等离子体射流
图5  工作气体Ar中掺杂不同O2或N2浓度时
等离子体射流处理2%乙醇溶液的放电图像Fig.5 Discharge images of 2% ethanol solution treated by plasma jet under different O2 or
N2 doping concentrations
相互作用的动态过程，通过ICCD相机拍摄了Ar+ O2/N2等离子体射流处理2%乙醇溶液的短时间曝光图像。
图6a展示了Ar+O2等离子体射流处理2%乙醇溶液的等离子体时空演化过程。随着O2掺杂浓度的升高，等离子体持续时间逐渐变短；当O2浓度为0.2%时，等离子体不能作用到液面；当O2浓度为1%时，等离子体不能喷出石英管管口。结合图3a 灭菌效果，分析认为，等离子体射流作用到液面的持续时间可能是影响灭菌效果的重要因素。图6b 展示了Ar+N2等离子体射流处理2%乙醇溶液的等离子体时空演化过程。随着N2掺杂浓度的增加（0～1%），等离子体在空气中传播的持续时间稍微变短（1 250ns→1 050ns），且仍一直能作用到液面。3.4气液界面发射光谱的分析
由于液相活性粒子可以通过气相活性粒子传质到水溶液中，并与水分子、有机溶质（主要是乙醇）、无机溶质（溶解O2、N2等）等反应产生，本节对气液界面激发态粒子的发射光谱进行了检测与分析。
（a）Ar+O2等离子体射流
（b）Ar+N2等离子体射流
图6  Ar+O2/N2等离子体射流处理2%乙醇溶液的
等离子体时空演化图像reactive oxygen species (ros)
Fig.6  Spatial-temporally resolved images of 2% ethanol solution treated by Ar+O2/N2 plasma jet

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