-646-Chia J Gastroenterco,2028,Vol.25,No.11•论著•
牛磺酸通过抑制氧化应激减轻放射性
肠损伤的实验研究*
李沁恺6沙桐4苏存锦2胡端敏E
苏州大学附属第二医院消化科1(215000)药剂科2
背景：氧化应激在电离辐射引起的肠道损伤和炎症反应中起关键作用。牛磺酸是一种广泛分布于体内的含硫氨基酸，具有抗氧化、抗炎等多种生物学功能。目的：研究牛磺酸对放射性肠损伤的作用及其潜在机制。方法：以CCK-7实验和细胞内活性氧(R0S)荧光探针DCFH-DA检测牛磺酸对电离辐射引起的人肠上皮细胞株HINC-7活力抑制和R0S蓄积的影响。以real-time PCR检测牛磺酸对体内、外辐射暴露后肠道细胞氧化应激相关基因表达的调节作用。以HE染和TUNEL染评估牛磺酸对全身辐射后小鼠肠道形态结构和细胞凋亡的改善作用。结果：体外实验中，牛磺酸可显著改善电离辐射引起的HIEC-6细胞活力抑制和细胞内R0S水平升高，并上调过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPxl)表达。体内实验显示，牛磺酸能激活核因子E2相关因子2/血红素氧合酶6(Nrf2/H06)信号通路，减轻辐射暴露引起的小肠绒毛结构紊乱和肠隐窝丢失，抑制肠道细胞凋亡。结论：牛磺酸可能通过激活Nrf2/H06抗氧化信号通路降低细胞内R0S水平，对电离辐射引起的肠道损伤发挥保护作用，是一种可用于放射性肠损伤的潜在药物。
关键词牛磺酸；放射性肠损伤；活性氧；Nrf2/H06信号通路
Experimental Strdy of tin Antioxitant Effect of Taurina Agaiasi Radiation-inducen Intestinal Injuriat LI Qinknf, SHA Tong,SU Curgirk,HU Duanmin.1Departmenh af Gastroenterology,，Department ef Paarmnch,thr Seconk ffrfiliateP Hospitni of Soochoo Unfenpy,Suzhon,Jiangsp Province(211000)
Correspondence ti：HUDuanmia,Email：huUuanmin@H.3om
Background：0xidative stress is crucial foa the develoomeni of ionizino raPiadon-inducen intestinal injuriee and iiiUammation.TauUde is a sulfur-tontainino amido acia distributen in tissees and oraane throuuhooi the body.Ii possesses several imyortant physiolooicyi fudetions,iycluUina anti-oxidative activity and anti-iIylammatoy effects.Aimt:To idvestiaate the therapentic effed and underlyino mechanism of tauride aaainsi raPiadon-inducen intesUyai injurieSi Methods：CCK-6assay and DCFH-6A,a fluorescence probe of intracellulaa reactive oxy p en species(R0S)were applieC to determine the effects of tauUne on raPiadox-inducen indididox of cell viaPilith and R0S acchmUation in human intesPnai epitheUal celi line HIEC6.The moOulatoa effects of taprine on expressions of oxidative stress-relateC henes in mtesPnai ceCs after exyosure to raPiation were measureC bp real-time PCR in f vitro and f owe stuUies.The roles of tauUne in maintenance of intestinal morpholohp and suppressi
on of celi apootosis in mice receivino whole boOp raPiation were assessed bp HE stainina and TUNEL stainina.Rrspltt:N in vitro stuUp,tauUne improved the raPiadon-induced indiaition of celi viaPilith and reCuceC intracenUar R0S acchmUation in HINC6ceCs.The expression levels of catalase(CAT)and hlutathione peroxidase1(GPxl)in HINC6cells were up-rehulated bp tauUne treatmenti3i give stuUp showed that tauUne activateC the nuclear f actoa erythroia2-relateC factoa2/heme oxypenase-1(Nrf2/H0-1) sianadna pathway,aCeviateC intestinal villl disoraanization and loss of crypt ceCs-and suppresseC celi apoptosis in mice after raPiation.Conclusion:: TauUne can renuce the intracellulaa R0S acchmulation via activatma Nrfe/H0-1800x1080sianaCna pathway,and thereCy,exerts protective e ffect apainst rayiaCon-induceX intestinal mjuries.It might be a candidate foa treatment of intestinal injuries in patients underaoina raPiotherapy.
D0I：16.3949/j.ind.1600-6125.2828.11.082
*基金项目：江苏省青年医学重点人才项目(QNRC281644)；姑苏卫生分层培养重点人才项目(GSWS2819812)
#Emaii：liqinkail992@199.1om
&本文通信作者，Emaii：huuuadmin@143
胃肠病学2222年第25卷第2期-440-
Key words Taurme；AraViaVou-fnduceX Intestinal Tjuees；Reactive Oxygen Species；
NrfO/HO-f Siadalina Pvhwap
电离辐射对于一些恶性肿瘤有较好的效果，但也会造成周围健康组织损伤[0]，放射引起的多种胃肠道症状，如便血、腹泻、吸收不良、恶心、呕吐、腹胀、腹痛等严重影响患者生活质量[22]0因此，减轻放射的毒性反应以提高患者生活质量在肿瘤期间至关重要0活性氧（reactive oxygen species,ROS）是体内一类氧的单电子还原产物，其在生理状态下参与细胞内信号转导、能量代谢，过多则对细胞产生损伤作用⑷。电离辐射与生物分子之间相互作用产生的ROS是引起放射性损伤的重要因素[52]o电离辐射造成的细胞内ROS蓄积引起氧化应激、线粒体膜通透性变化、DNA损伤、细胞凋亡以及炎症相关信号通路激活和促炎细胞因子分泌增加、抗炎细胞因子分泌减少，是放射性肠损伤的关键病理生理环节[722]o牛磺酸（tauene）是一种结构简单的含硫氨基酸，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生物学功能，研究显示其可明显改善辐射引起的肾、脑、睾丸、肺等组织器官损伤S223。本研究通过体、内外实验探讨牛磺酸对放射性肠损伤的作用及其潜在机制，以期为牛磺酸应用于放射性肠病的临床提供理论依据。
材料与方法
一、细胞株、实验动物和主要试剂
正常人肠上皮细胞株HIEC-6（上海雅吉生物科技有限公司）以RPMA1044培养基（添加2%胎牛血清、2%青-链霉素配制成完全培养基），培养于30°C、5%CO?恒温培养箱中o
4~8周龄雄性BaD/c小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）平均体质量约22a，饲养于SPF 级环境中，温度22~25C，相对湿度3。％~55%, 2h明暗周期，自由摄取饲料和饮水。动物实验方案经苏州大学动物伦理委员会审核批准。
牛磺酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Cell Counting Kg-8（CCK2）细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒、细胞核荧光染料DAPETUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显法；上海碧云天生物技术有限公司）；细胞内ROS荧光探针DCFH-DA（MedChem-Exyress.）;TRA o U M试剂（（nvitrogenT M,Themio Fishee Scientific t;RevertAig First Strand cDNA Synthdis Kit （Themio Fisyar Scientific）；SYBR Premia EX Tdq （Peeeci Rxl Tima；TaUara Bio Ide.）o
、法
0．体实验
①细胞活力检测:HIEC-2细胞以每孔2x24个接种于96孔培养板,30C、5%CO2饱和湿度培养箱中培养2h
至细胞贴壁°将牛磺酸分别配制成44mmol/L和2。mmol/L浓度的溶液。将细胞分为四组：对照组（CON组）、辐射组（RAD组）和RAD+ TAU（44mmol/L）组、RAD+TAU（102mmol/L）组，后两组每孔培养基中加入2配制好的牛磺酸溶液，培养2h后予电离辐射处理（X射线辐照，照射剂量2Gy，剂量率2.98Gy/min）；辐射处理后继续培养24h，每孔加入2CCK2试剂后培养2h，以酶标仪检测各孔吸光度值（4值）°细胞活力=（实验组4值-空白组4值）/（对照组4值-空白组4值）实验设3个复孔，结果取均值。
②细胞内ROS检测：以无血清RPMA1044培养基将ROS荧光探针DCFH-DA按2：1OO。的比例稀释，浓度为2jimol/Lo电离辐射后6h，各组HIEC-4细胞去除培养基，加入含DCFH-DA荧光探针的培养基,30C培养箱中孵育22min；去除培养基，无血清培养基洗涤细胞3次以充分洗去未进入细胞的DCFH-DA；于培养孔中加入细胞核荧光染料DAPI 避光染2mid；PBS洗涤2次，荧光显微镜下观察、拍照。
③R eal-time PCR检测氧化应激相关基因表达：电离辐射后4h,TRAo）试剂提取各组细胞总RNA，根据ReveeAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书配制逆转录体系，合成第一链cDNA，以之为模板，使用Applied Biosystems752快速实时荧光定量PCR系统行real-time PCR扩增，反应体系的配制和反应条件参照SYBR Premie EX Taq（Perfect Real Tima）说明书，引物序列见表2o内参照基因使用GAPDH，以2-AA C s法计算目的基因mRNA相对表达量。
2-体内实验
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648-Chin J Gasmoepmni,2020,Vol.25,No.11
表1Real-time PCR引物序列
目的基因引物序列
CAT F5'-AGC GAC CAG ATG AAG CAG TG2'
R6-TCC GCT CTC TGT CAA AGT GTG2'
GPxl F5'-AGT CCA CCG TGT ATG CCT TCT-2'
R6-GAG ACG CGA CAT TCT CAA TGA2'
NUO F5'-TCT TGG AGT AAG TCG AGA AGT GT2'
R5'-GTT GAA ACT GAG CGA AAA AGG C2'
HO2F5'-AAG CCG AGA ATG CTG AGT TCA2'
R5'-GCC GTG TAG ATA TGG TAC AAG GA2' GAPDH F5'-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG2'
（内参照）R5'-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA2' CAT：过氧化氢酶（catalase）；GPxl：谷胱甘肽过氧化物酶1（glu-tathiope peroxinase1）;Neo：核因子E2相关因子2（cuclear factor 600（X02-related factor2）；HO-1：血红素氧合酶2（heme oxy/enase-1）
①动物分组和造模：将实验小鼠随柳
组：对照组（CON组）、全身辐（RAD组）和全身辐射+牛磺酸干预组（RAD+TAU组），每组6只。X射线全身辐射剂量为19Gy，剂量率为0.98Gy/mic。RAD+TAU RAD别于X照3d 开始每日1次注射牛磺酸1OO。my/Uy或等体积9%NaCi溶液，照射当日于照34min腹腔注射一次，照射后继续每注射；对照鼠不予X照射，仅注射溶液。照射后3.9d处死小鼠（处死当日不予腹腔注射），进行后续实验。
②小肠获取：4%水合氯醛麻醉小鼠，剪开，分离心脏，由心，剪开右心耳，。^% NaCl溶液全身。于肠1cm肠组织，用于real-time PCR检测。4%多聚甲醛灌注直鼠四肢僵硬，一段小肠，4%
醛固定待测。
③R eal-timv PCR检测小肠组织CAT基因表达：方法同细胞实验。
④组织病理学检查和细胞凋亡检测：小肠组织标本以4%固定48y常规，垂直于肠4p m厚连续，行HE，，并参照试剂盒说明TUNEL染，观察小肠病理学细胞凋亡情况。
三、统计学分析
用SPSS18.4软件进计学分析。计量资料以x±s表示，比较采用单因差分析，进一步的两两比较采用LSD法^<2.45为差异有统计学意义。使用GraphPad Pnsm5软件制图。
结果
一、牛磺酸改善电离辐射引起的人肠上皮细胞活力抑
人肠上皮细胞株HIEC-6作为研究对象，通过体外实验研究牛磺酸预处理对电离辐射引起的肠道细胞活的影响。既往研究显示牛磺酸的细胞毒性很小，故直接选用44mmol/U和H mmol/L两个剂量进行实验。CCK2实验结果显示，19Gy电离辐射可显著抑制HIEC-6细胞活力，与未予牛磺酸预处理者相比，经H mmol/L牛磺酸预处理的HIEC-6细胞活力明显增加，差异有计学意义（卩小心；图1），表明H mmol/L牛磺改善电辐的人肠上皮细胞活。后续体外实验步骤均使用I。。mmol/L牛磺酸。
图1牛磺酸对电离辐射引起的HIECt细胞活力抑制的影响
二、牛磺酸降低电离辐射后人肠上皮细胞内的ROS水平
ROS荧光探针DCFH-DA检测显示，与未经电离辐射者相比，辐射暴露后的HIEC-6细胞内ROS 水平明显
升高，牛磺酸预处理则可有效抑制辐射引的细胞内ROS水平升高（图2），表明牛磺酸可降低电离辐射后人肠上皮细胞内的激水平。
三、牛磺酸调节电离辐射后氧化应激相关酶表达
进一步探索牛磺酸对氧化还原平衡的影响，研究采用real-time PCR检测了电离辐射后氧化应激相关酶的体内、、水平。体外实验中，
辐射
胃肠病学282/年第25卷第/期
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暴露后的HIEC-6细胞内抗氧化分子CAT 、GPxl
mRNA 相对表达量明显
，牛磺酸预处理则可有效上 者 ，差异均有统计学意义（P<8.85；3A 、3B ）。体内实验中，与未予全身辐射的小鼠 相比，辐射后3. 5 d 小鼠小肠组织CAT  mRNA 相对
量明显 ，牛磺 预则可上调CAT  mRNA 表达，差异均有统计学意义（P<8.85；图3C ）o
四、牛磺酸激活Ni/信号通路调控
激保护小鼠肠道细胞于牛磺酸对 激相关酶的调节作用，研究进一步探讨了牛磺酸对 激系统的调节机因子nuu 是细胞抗
激的重
节
因一，可在 水平上调下游抗氧化因 t 达，对细胞发挥保护作用［4。Real-time  PCR 检测
显示，与未予全身辐射的力、鼠相比，辐射后3. 5 d 小
鼠小肠 NUe  mRNA 相对表达量明显升高（P  <8.35），这
是由于辐 致细胞内NU2信号通路激活,NU2： 性增加，牛磺 预则可进一步上调N uu  mRNA 表达（P  <8.85） , NUe 下游靶 基因H0-1的表达变化与之相一致（图4）o
、牛磺 全身辐射后小鼠肠上皮结构的
性
本实验步骤评估了牛磺酸对全身辐射后小鼠小肠结构的保护作用。辐射后3.5 d 小鼠小肠出现 严重损伤, 肠
、水肿、变薄、褶皱减少，肠内
稀；经牛磺
预的辐射暴露后小鼠无
论是肠壁情况还是肠内容物均有明显改善（图
5A ） o  HE 染显示，辐射后3.3 d 小鼠小肠上皮出
现不同程度的绒毛短缩和肠隐窝 ，肠绒毛部分
缺如、绒毛 ；牛磺 预则可部
肠绒毛和肠隐窝的 性（图5B ）。上
明，牛磺 减 全 辐 的肠道
。
、牛磺 全身辐射后小鼠肠道细胞凋亡
细胞凋亡是辐射暴露后肠道细胞死亡的关键 机制，凋亡导致的绒毛上皮细胞和隐窝干细胞
是腹部 治 胃肠道 的重要
因［/。本研究TUNEL 染显示，与未予全身辐
的小鼠相比，辐射后3. 5 d 小鼠小肠隐窝内有大
量
的凋亡细胞，牛磺 预则可显著改善肠隐窝 绒毛细胞凋亡（ 4）。 上
明，
牛磺 减少全 辐 的肠道细胞凋亡。
讨 论
本研究探讨了牛磺酸对放射性肠损伤的保护
作用及其 ，研究结果表明，牛磺 通过
蓝荧光为细胞核，绿荧光为R0S 阳性细胞
DAPI/R<J
1
两组间比较，* P<8.35, ** P<8.31, *** P<8.308 1
图3牛磺酸对辐射暴露后HIEC£细胞（A 、B ）和小鼠小肠组织（C ）
氧化应激相关酶表达的影响
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Chia  J  GasAoedAni , m  Vol. 25, Ne. 2
图4牛磺酸对全身辐射后小鼠小肠组织Nrf2及其
下游靶基因HO-1表达的影响
上调抗氧化应激相关酶表达而减少辐射暴露后人
肠上皮细胞内的ROS 蓄积。具体而言，牛磺 激
reactive oxygen species (ros)活Nea/HO2信号通路，发挥抗 作用。体内实
验结果表明，牛磺 减轻全身辐
的肠道损
伤，维持肠上皮
性，减少肠道细胞凋亡。
上 牛磺酸用于 性肠损伤的提供
了理论依据。
ROS 在电离辐射引起的肠道损伤和炎症反应
中起关键作用E^o ROS.
粒体产生，细胞呼 程中，线粒体呼吸链“电 ”会使少量电子
与氧直接
生超
O 2-, ROS ，并
在 的 下继续形成H 2O 2[J 4]o 细胞暴露于
电离辐 ，线粒体膜电位发生 ，线粒体
CON
RAD
RAD+TAU
A ：小肠组织大体图；
B ：HE 染图（X4）
%
和 a
图5牛磺酸对全身辐射后小鼠小肠结构的保护作用
CON
RAD
RAD+TAU
图6牛磺酸对全身辐射后小鼠小肠隐窝上皮细胞凋亡的保护作用（TUNEL 染,X40
）

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