22上海交通大学学报（医学版）2019, 39 (1)
人气道黏液中最主要的分泌型黏蛋白成分为黏蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC），对呼吸道起着重要的润滑和保湿作用；但在慢性气道炎症性疾病尤其是急性加重期时，气道黏液分泌行为有别于疾病缓解期或稳定期，常常以“速发相”模式分泌大量酸化、黏稠的黏液[1-2]。受促黏液分泌因素刺激后，气道杯状细胞内MUC5AC基因转录及蛋白合成会急剧增加，细胞质短时间内出现大量需进一步折叠修饰的MUC5AC雏形肽。目前对MUC5AC基因转录及蛋白合成的分子机制已有大量研究报道[3-4]，但杯状细胞内质网是怎样提高承载能力并在短时间内顺利完成对大量MUC5AC雏形肽复杂的加工，目前尚不明确。
黏蛋白过度生成需要增加蛋白质折叠和上调分泌能力，这都可以由内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）引起的未折叠蛋白反应调节[5]。ERS是细胞内质网对适度负性刺激的一种“代偿性扩容”机制，使得内质网处理靶蛋白的能力提升。但促使MUC5AC分泌增加的刺激因素能否引起ERS，ERS信号分子对MUC5AC蛋白合成的影响如何，目前相关报道仍较少。研究[5-6]显示白细胞介素13（IL-13）、过敏原能通过ERS诱导MUC5AC生成，但未涉及具体分子。有报道[7-8]称，ERS通路需肌醇酶1α（inositol-requiring kinase 1，IRE-1α）参与正常分泌性蛋白代谢及炎症因子生成。本研究选择中性粒细胞弹力蛋白酶（neutrophil elastase，NE）这一重要的MUC5AC 促动剂作为诱导因素，探讨ERS在NE诱导MUC5AC 生成中的作用，以期进一步认识气道黏液高分泌的分子机制。
1材料与方法
1.1  主要试剂与仪器
人支气管上皮样细胞株HBE16（美国ATCC细胞库），IRE-1α小干扰RNA（siRNA）、 X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP-1）siRNA、对照siRNA、鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG （美国Santa Cruz公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、兔抗人磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶（phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，pPERK）（Thr980）单克隆抗体、噻唑蓝（MTT）检测试剂盒（北京碧云天生物技术公司），兔抗人葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）多克隆抗体（ab230508）、兔抗人蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）多克隆抗体（ab77654）、兔抗人活化转录
因子6（activating transcription factor 6，ATF6）多克隆抗体（ab37149）、兔抗人IRE-1α多克隆抗体（ab37073）、兔抗人磷酸化IRE-1α（pIRE-1α）（Ser724）多克隆抗体（ab48187）、兔抗人XBP-1多克隆抗体（ab37152）[该抗体可同时识别剪切的XBP-1（spliced XBP-1，XBP-1s）和未剪切的XBP-1（unspliced XBP-1，XBP-1u）蛋白]（英国Abcam公司），人MUC5AC ELISA试剂盒（美国R&D公司），小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体（美国Neomarkers公司），NE、ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate，4-PBA）、ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）（美国Sigma-Aldrich公司），X-tremeGENE siRNA转染试剂（瑞士Roche公司）。自动酶标仪F039300（奥地利TEC
AN公司），激光共聚焦显微镜平台（德国Leica公司），荧光酶标仪（美国Molecular Devices公司）。
1.2  MTT比法检测细胞增殖活力
参照文献[9]行MTT比法以选取合适的NE浓度。96孔板中每孔加入200 µL细胞悬液（1×104/mL），分别用25、50、100、200 ng/mL NE处理细胞，每个处理组6个复孔，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱孵育，分别于8、12、24、36、48 h行MTT检测。吸除各孔培养液，加入无血清的RPMI 1640培养液（200 μL/孔）及MTT溶液（20 μL/孔），放入培养箱继续培养4 h。吸除各孔培养液，加入二甲基亚砜（150 μL/孔），室温下微量振荡器上振荡15 min，在自动酶标仪上以570 nm波长测定各孔吸光度值[D（570 nm）]。
1.3  细胞的处理及分组
HBE16细胞以RPMI 1640培养液常规培养，分组如下。①空白对照组：细胞正常培养，不予任何处理。
reactive oxygen species (ros)
②单纯NE组：细胞予以100 ng/mL NE处理。③NE+ 4-PBA组：在加入NE前30 min加入10 mmol/L 4-PBA[10]。
④NE+NAC组：在加入NE前30 min加入3 mmol/L NAC[11]。⑤NE+对照siRNA组：细胞转染对照siRNA 后加入NE。⑥NE+IRE-1α siRNA组：细胞转染IRE-1α siRNA后加入NE。⑦NE+XBP-1 siRNA组：细胞
转染XBP-1 siRNA后加入NE。继续孵育24 h后行相关检测。
1.4  ROS的检测
细胞予以不同浓度的NE刺激（25、50、100 ng/mL）24 h，采用ROS试剂盒测定，按操作说明进行。收集细胞，悬浮于无血清培养液稀释的DCFH-DA荧光探针溶
23
液（1:1 000稀释，终浓度10 μmol/L），调整细胞浓度至5×106/mL，经细胞培养箱孵育20 min，充分混匀，无血清培养液洗涤细胞3次，酶标仪检测。
1.5  细胞转染
细胞接种至24孔板（细胞密度1.5×105/mL），每孔加入0.45 mL无血清RPMI 1640培养液。5 μL siRNA转染试剂加入45 μL无血清培养液中混匀，1 μg的IRE-1α siRNA、XBP-1 siRNA或阴性对照siRNA分别加入50 μL 无血清培养液中稀释混匀。将这2种溶液混合均匀后室温孵育20 min，逐滴加入各孔细胞中，轻柔振荡混匀，孵育16 h后吸弃上清，PBS轻柔洗涤细胞3次，换用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养以待后续操作。
1.6  ELISA检测MUC5AC蛋白含量
分别收集细胞培养上清液和细胞，裂解细胞后提取细胞总蛋白，测定并调整蛋白浓度备用。采用人MUC5AC ELISA试剂盒分别测定细胞培养上清液和细胞总蛋白中MUC5AC的含量，加入待检样品、标准品于酶标包被板，按说明书操作进行，终止反应后测D （450 nm）值，与标准品比较得到MUC5AC的相对含量。
1.7  Western blotting检测各蛋白含量
以含苯（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的细胞裂解液冰上裂解细胞，提取细胞总蛋白，测定并调整蛋白浓度备用。样品经5%～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，250 mA电转1 h至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，于PBS（含0.05%吐温-20和5%脱脂牛乳）中封闭1 h后，分别加入兔抗人GRP78、pPERK、PERK、ATF6、pIRE-1α、IRE-1α、XBP-1多克隆抗体，鼠抗人β-actin单克隆抗体（均为1:500稀释）室温孵育2 h，洗膜后分别加入HRP标记的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG（1:1 000稀释），室温下不断摇动孵育2 h。彻底洗涤后经增强化学发光法（ECL）显，BioRad图像采集仪成像，以Quantity one软件进行灰度值分析，将各组目的蛋白与内参β-actin的比值作为目的蛋白的相对含量。
1.8  实时荧光定量PCR检测XBP-1s mRNA
采用TRIzol法分别提取各组细胞内的总RNA，初步定量后保存于-20 ℃备用。随后以两步法行实时荧光
定量PCR。反转录按试剂盒说明书操作。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）上、下游引物序列分别为5'-GGGAAGGTGAAGGTGGGAGTG-3'和5'-AGCAGAGG-
GGGCAGAGATGAT-3'。参照文献[12]合成XBP-1s的引物，上、下游引物序列分别为5'-GGAGTTAAGACA- GCGCTTGG-3'和5'-GTCAATACCGCCAGAATCC-3'。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 35 s，56 ℃ 55 s，72 ℃30 s，共40个循环；72 ℃延伸3 min。采用2－ΔΔC t方法分析目的基因mRNA相对表达量。
1.9  免疫荧光检测细胞MUC5AC蛋白表达
贴壁生长良好的HBE16细胞经消化后，制成细胞悬液，调整细胞密度至1×105/mL，接种于铺有1 cm×1 cm 细胞爬片的24孔板中，按前述分组处理及培养。取出已有细胞贴壁的爬片用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定30 min；再用PBS洗涤3次，以0.1% Triton X-100通透15 min；PBS洗涤3次，以山羊血清封闭液封闭45 min，加入小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体150 μL （1:200稀释）并4 ℃孵育过夜。次日PBS洗片3次，加入羊抗鼠异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）荧光二抗（1:200稀释），避光孵育1 h。洗片3次，加入5%碘化丙啶（propidium iodide，PI）染核5 min，经PBS洗片5次，50%甘油封片。激光共聚焦显微镜下观察，以Image Pro Plus软件分析细胞相对荧光强度。
1.10  统计学方法
应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，所有数据均以x—±s表示，根据数据正态性及方差齐性与否分别采用参数检验和非参数检验，符合正态分布及方差齐性的资料采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验；不符合条件的资料采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1  细胞增殖活力检测
25 ng/mL～100 ng/mL NE组在8～48 h的时间范围与空白对照组相比，D（570 nm）值差异无统计学意义，表明此时间和浓度范围内的NE对细胞增殖活力没有明显影响。200 ng/mL NE组在36 h和48 h的D（570 nm）值与空白对照组相比显著降低（均P<0.05）（图1），故将100 ng/mL作为本实验适宜的NE刺激浓度。
2.2  NE诱导细胞ROS生成增加
ROS检测结果显示：NE刺激后细胞ROS生成增加，且随NE浓度增加，ROS含量逐渐增多。与空白对照组相比，100 ng/mL NE组升高最为显著（P=0.000）（图2）。
李 琪，等   内质网应激通路需肌醇酶1α/X盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用
24上海交通大学学报（医学版）2019, 39 (1)
2.3  NE通过ROS诱导细胞ERS相关蛋白表达增加
Western blotting结果显示：100 ng/mL NE刺激细胞24 h 后，GRP78蛋白合成增加，pPERK、pIRE-1α、A TF6蛋白含量较空白对照组均显著增加（均P<0.05）。ROS抑制剂NAC预处理细胞后，GRP78、pPERK、pIRE-1α、A TF6蛋白表达较单纯NE组均明显减少（均P<0.05）（图3）。说明NE通过ROS的生成诱导了细胞ERS反应。予以4-PBA 处理的细胞组中，显示出与NAC组相似的结果。
注：①P=0.031，②P=0.025，与相应时间点的空白对照组比较。图1不同浓度NE对细胞增殖活力的影响
Fig 1  Effect of NE at different concentrations on cell proliferation 注：①P=0.005，②P=0.000，与空白对照组（0 ng/mL）比较。图2不同浓度NE对细胞ROS生成的影响
Fig 2  Effect of NE at different concentrations on ROS production
注：A. 蛋白条带；B. GRP78蛋白相对含量；C. PERK、pPERK蛋白相对含量；D. ATF6蛋白相对含量；E. IRE-1α、pIRE-1α蛋白相对含量。1为空白对照组，2为单纯NE组，3为NE+NAC组，4为NE+4-PBA组。①P=0.000，⑥P=0.002，与空白对照组比较；②P=0.009，③P=0.006，④P=0.000，⑤P=0.007，⑦P=0.002，⑧P=0.004，⑨P=0.007，⑩P=0.005，与单纯NE组比较。
图3各组ERS相关蛋白分子的表达情况
Fig 3  Expression of ERS-related proteins in each group
2.4  NE诱导XBP-1s蛋白及mRNA表达增加
Western blotting结果显示：与空白对照组相比，NE 刺激后细胞中XBP-1s蛋白水平显著增加（P=0.000）；NAC、4-PBA预处理组中，XBP-1s蛋白水平较单纯NE组明显降低（均P<0.05）；NE+IRE-1α siRNA组、NE+XBP-1 siRNA组的XBP-1s蛋白水平也较单纯NE组
A B
D C E
25
显著降低（均P <0.05）（图4）。
PCR 结果显示：与空白对照组相比，单纯NE 组细
胞中XBP-1s  mRNA 水平显著增加（P =0.000）；NAC 、4-PBA 预处理组及NE +IRE-1α siRNA 组、N
E +XBP-1 siRNA 组的XBP-1s  mRNA 水平均较单纯NE 组明显降低
（均P <0.05）（图5）。
注：
A. 蛋白条带；
B. XBP-1s 、XBP-1u 蛋白相对表达水平。1为空白对照组，2为单纯NE 组，3为NE +NAC 组，4为NE +4-PBA 组，5为NE +对照siRNA 组， 6为NE +IRE-1α siRNA 组，7为NE +XBP-1 siRNA 组。①P =0.000，与空白对照组比较；②P =0.009，③P =0.006，④P =0.000，⑤
P =0.007，与单纯NE 组比较。图4  不同干预因素对XBP -1蛋白表达的影响
Fig 4  Expression of XBP-1 protein in different treated groups
2.5  IRE-1α/XBP-1参与NE 诱导的MUC5AC 分泌ELISA 结果显示：单纯NE 组细胞及培养上清液中的MUC5AC 蛋白均较空白对照组显著增加；而经NAC 或4-PBA 预处理后，细胞及培养上清液中的MUC5AC 蛋白均较单纯NE 组显著减少（均P <0.05），表明ERS 参与了NE 诱导的MUC5AC 分泌。进一步试验结果显示，细胞
分别转染IRE-1α siRNA 或XBP-1 siRNA
后，细胞及培养上清液中的MUC5AC 蛋白水平均较单纯NE 组明显降低
（均P <0.05）（图6）。
细胞免疫荧光结果显示：NE +NAC 组、NE +4-PBA 组、NE +IRE-1α siRNA 组、NE +XBP-1 siRNA 组
中的MUC5AC 荧光强度均较单纯NE 组降低（均P <0.05），表明ERS 信号因子IRE-1α、XBP-1参与了NE 诱导的MUC5AC 分泌
（图7）。
注：
A. NAC 、4-PBA 干预后XBP-1s  mRNA 相对表达水平；
B. siRNA 转染后XBP-1s  mRNA 相对表达水平。1为空白对照组，2为单纯NE 组，3为NE +NAC 组，4为NE +4-PBA 组，5为NE +对照siRNA 组，6为NE +IRE-1α siRNA 组，7为NE +XBP-1 siRNA 组。①P =0.000，与空白对照组比较；②P =0.011，③P =0.014，④P =0.006，⑤
P =0.000，与单纯NE 组比较。
图5  不同干预因素对XBP -1s  mRNA 表达的影响
Fig 5  Expression of XBP-1s  mRNA in different treated groups
A
A B
B
李 琪，等    内质网应激通路需肌醇酶1α/X 盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用

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