肝脏疾病专题竹节香附素A通过ULK1/Atg13及ROS途径
调控肝癌细胞自噬的作用研究
赵利，马向明，王碳，吉瑞更，付庆江，曹立赢
基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划项目（20181712)；唐山市科学技术研究与发展计划项目（18130237a)
作者单位：063001唐山，丌溧总医院肝胆外科
通信作者：曹立赢，E-mail:*********************
【摘要】目的探讨竹节香附素A通过自噬激活激酶1(U L K1)/自噬相关蛋白13(A tg l3)及活性氧（ROS)途
径调控肝癌细胞自噬的作用。方法2019年8 —9月于开滦总医院实验室进行实验，设肝癌HePG2细胞组、5-氟尿嘧
啶组(80 m y W)、竹节香附素A低剂量组（100 m V W)、竹节香附素A高剂量组(200 m g/jU)，4组每孔设6个平行样，
培养72 11，培养结束后，测定细胞存活率、自噬、凋亡率，检测1]1^1、人增13 11111财和蛋白水平，2,7-二氯二氢荧光素二
乙酸酯（DCFH-DA)测定R0S水平。结果与肝癌HePG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组
HepG2细胞0D值、存活率降低（P<0.01)，自噬小体、HepG2细胞凋亡率、U LK l、Atg13 mRNA和蛋白表达、R0S水平
升高（/><0. 01)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组细胞O D值、存活率升高Q/P=21. 214/0. 000、
19. 547/0. 000、18. 547/0.000、25.478/0.000)，自噬小体、凋亡率、ULK1、Atgl3 mRNA 和蛋白表达水平、ROS 水平降低
(t/P = 16. 325/0. 000,22. 547/0. 000,9. 874/0. 000,16. 589/0. 000,13. 654/0. 000,14. 654/0. 000,16. 589/0. 000,
21.247/0. 000、21.687/0.000、18, 324/0. 000、18. 541/0. 000、19. 587/0.000、19. 654/0.000、24.052/0.000)；与竹节香附
素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组细胞O D值、存活率降低〇/P二16. 547/0.000、23. 547/0.000)，自噬小体、
凋亡率、ULICl、Atgl3 mRNA 和蛋白表达水平、R0S 水平升高（t/_P 二15. 696/0. 000、10. 654/0. 000、14. 697/0. 000、
18.324/0.000、17.024/0.000、：19.634/0.000、18.547/0.000)。结论竹节香附素A能明显抑制肝癌细胞增殖，促进
肝癌细胞自噬及凋亡；其机制与竹节香附素A激活U LK1/A tgl3及R0S通路有关。
【关键词】竹节香附素A;ULK1/Atg_13通路；活性氧；肝癌细胞；自噬
【D0I】10.3969/j. issn. 1671-6450.2020.10.007
Study on the effect of raddeanin A in regulating autophagy of hepatocellular carcinoma cells through ULK1/Atgl3
and ROS pathway Zhao Li, Ma Xiangming, Wang Ying, Ji Ruigeng, Fu Qingjiang, Cao Liying. Department of Hepatobi
liary Surgery^ Kailuan General Hospital, Hebei Province yTangshan 063001 , China
Corresponding author：Cao Liying，E-mail: caoliyingl964@ 126. com
Funding program：Hebei Province Medical Science Research Key Project(20181712) ；Tangshan Science and Technology Re
search and Development Plan Project(18130237a)
【Abstract】Objective To explore the role of Raddeanin A in regulating the autophag}^ of liver cancer cells through autophagy activated kinase 1( ULK1)/autophagy-related protein 13 ( Atgl3 ) and reactive oxygen species ( ROS) pathways. Methods The experiment was carried out in the laboratoiy of Kailuan General Hospital from August to September 2019, in
cluding the liver cancer HepG2 cell group, 5-fluorouracil group (80 mg/fxl) , Raddeanin A low-dose group (100 m g/|jul), Raddeanin A high-dose group (200 mg/(jil) , 6 parallel samples in each well of 4 groups were cultured for 72 hours. After the
culture, the cell sunaval rate, autophagy and apoptosis rate were measured, and ULK1 , Atgl3 mRNA and Protein level, 2,7- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) measures ROS level. Results
Compared with the HepG2 cell group of liver
cancer, the 5-fluorouracil group and the low-dose and high-dose group of Raddeanin A of HepG2 cell OD value and survival
rate decreased (P < 0. 01 ) , autophagosome, HepG2 cell apoptosis rate, ULK1, Atgl3 mRNA and protein expression, and
ROS levels increased (P<0.01)；compared with the 5-fluorouracil group, the cell OD value and survival rate of the low and
high doses of Raddeanin A was increased (^/P = 21.214/0. 000, 19. 547/0. 000, 18. 547/0.000, 25. 478/0. 000) , autophagosomes, apoptosis rate, ULK1 ?Atgl3 mRNA and protein expression levels, and ROS levels decreasexl (t/P=16. 325/
0.000, 22.547/0.000, 9.874 /0.000, 16.589/0.000, 13.654/0.000, 14.654/0.000, 16.589/0.000, 21.247/0.000,
21.687/0.000, 18.324/0. 000，18.541/0. 000, 19. 587/0. 000, 19. 654/0. 000, 24.052/0. 000); compared with Rad- deanin A low-dose group, the cell OD value and sundval rate o f the high-dose gr
oup decreased (t/P=16. 547/0. 000, 23.547/0.000), autophagosomes, apoptosis rate, U L K1, A tg l3mRNA and protein expression levels, and ROS levels increased (i/P = 15. 696/0.000, 10.654/0.000, 14.697/0.000, 18.324/0.000, 17.024/0.000, 19.634/0.000, 18.547/ 0.000) . Conclusion Raddeanin A can significantly in h ib it the proliferation o f live r cancer cells and promote autophagy and apoptosis of live r cancer c e lls；its mechanism is related to the activation of U L K1/A tg l3and ROS pathways by Raddeanin A.
【Key words】Raddeanin A; U L K1/A tg l3pathway；Reactive oxygen species ；Hepatocellular carcinoma c e lls；Auto- phagy
肝癌在全球癌症相关死亡中排名第二，早期肝癌 患者及时诊断预后良好，5年生存率> 70%，若肝癌进 人晚期，5年生存率<16%n_3]。自噬是一种细胞内 降解途径，是一种复杂的分解代谢过程，涉及长寿命蛋 白质的循环和分解，以及细胞内无用细胞器的降解。作为细胞稳态的重要调节剂，自噬与肿瘤细胞的存活 相关[4_5]。越来越多的证据表明，在各种抗癌药诱导的 细胞死亡过程中，细胞凋亡和自噬之间存在复杂的功 能关系。竹节香附素A具有抗炎、抗肿瘤和抗菌能 力，其通过诱导癌细胞凋亡实现作用在MCF-7乳腺癌细胞中，竹节香附素A诱导自噬，通过 降低耐药性来杀伤癌细胞。活性氧（R0S)是自噬相关 的上游细胞因子，可诱导自噬激活激酶1(ULK1)/自噬相关蛋白13 (Atgl3 )过表达进而激活自噬通路[8]。本研究拟探讨竹节香附素A通过ULK1/Atgl3及R0S 途径调控肝癌细胞自噬的作用，为肝癌的提
供理 论依据，报道如下。
1材料与方法
1.1材料（1)实验细胞：肝癌HePG2细胞购自中国 科学院典型培养物保藏委员会细胞库，批号18091603。（2)试药试剂：L-谷氨酰胺、青霉素、链霉 素、胎牛血清（FBS)购自美国Gibco公司；竹节香附素 A购自上海安谱实验科技股份有限公司;5氟尿嘧啶、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、吖啶橙染试剂盒购自 美国sigma公司；HEPES缓冲液、裂解缓冲液、BCA蛋 白法含量测试盒、5%牛血清白蛋白（BSA)、ECL化学 发光检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；膜联蛋 白V-异硫氰酸荧光素（FITC)、TRIz〇l试剂购自美国 公司；ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自美国NEB公司；SYBR Premix Ex Taq II试剂盒购自日本Takara公司；PVDF膜购自北京明 阳科华生物科技有限公司；ULK1、Atgl3、(3-actin—抗 购自安诺伦(北京）生物科技有限公司；辣根过氧化物 酶标记IgG二抗购自美国Abeam公司；2,7_二氯二氢 荧光素二乙酸酯（DCFH-DA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。（3)仪器:MK-9型酶标仪购自美国 伯乐公司；Olympus CKX31型荧光显微镜购自日本Olympus公司；XC-987型流式细胞仪购自美国BD公 司；QuantStudio5型实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司;LAS3000型显影仪购自美国赛默飞世尔科 技公司。
1.2肝癌HePG2细胞培养及分组2019年8 —9月于开涞总医院实验室进行实验。肝癌HePG2细胞接 种于
DMEM培养基，在37^、5%C02的正常培养环 境中培养。分组：肝癌HePG2细胞组、5-氟尿嘧啶组、竹节香附素A低剂量组、竹节香附素A高剂量组，在 细胞培养过程中干预组分别加人5氟尿嘧啶（浓度为 80 mg/p l，预试验求出5氟尿嘧啶的LC50为160 pg/ ml，以1/2 LC50为作用剂量）、不同剂量的竹节香附素 A，竹节香附素A低、高剂量分别为100、200 mg/p l。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。
1.3观测指标与方法
1.3.1细胞增殖水平测定：将肝癌HepG2细胞以2 x 1〇4个/孔的密度接种到96孔板中，与无血清培养基 孵育4 h，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞存 活率，在酶标仪450 n m波长处读取吸光度值（0D 值）。细胞存活率=(实验组0D-空白组0D)/(对照 组0D-空白组OD)X100%。
1-3.2细胞自噻检测：通过吖啶橙染观察自噬情 况。将HePG2细胞(6 x105个/孔）接种到18 mm x18 mm盖玻片的6孔培养板中，并用磷酸缓冲液4 p i处 理72 h，然后冲洗并用吖啶橙（10 mg/L)在37尤染 持续30 min，盖上盖玻片后，使用荧光显微镜观察样 品，以评估从绿到红的颜变化。细胞质内出现 酸性自噻小体（红），说明细胞发生自噬，为阳性细 胞；细胞质内出现绿荧光，说明细胞未发生自噬，为 阴性细胞。于高倍镜下随机计数1 〇〇〇个细胞，并计 数自噬小体个数。
1.3.3肝癌HepG2细胞凋亡检测：各组肝癌HepG2 细胞培养结束后，收获细胞，磷酸盐缓冲液洗涤1次并
离心，使用膜联蛋白V/P I双染的流式细胞术分析 细胞凋亡。将全细胞收集在HEPES缓冲液（PH 7. 4 的 10 mmol/L HEPES,140 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L CaCl2)中，随后，用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)(2.5 pg/ml)和 PI(2 ng/ml)染细胞 20 min，然后在流式细胞仪上进行分析，使用Cell Quest软件 分析凋亡水平，早期凋亡（膜联蛋白V + /PI-)和晚期 调亡（膜联蛋白V+/PI+ )的总和为总细胞调亡。
1.3.4 细胞 ULK1、Atgl3 mRNA 水平测定：TRIzol试 剂分离肝癌HepG2细胞总RNA，使用ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒逆转录RNA，使用 SYBR Premix Ex Taq II试剂盒进行定量PCR分析，制 备20 (j J反应体系，在实时荧光定量PCR仪中进行反 应，将靶基因的表达标准化为(3-actin。所有引物均由 上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列:ULK1正 向 5 '-CGGTAGTTTGCCGTGAGTGA-3、反向 5 '-CCGT-GACGCTCCCGTGGATG-3Atgl3 正向 5 :CCGTGTGATT-GGCTTCCGCCGTGAC-3'反向 5 :CCTGTGTGACTCCCT-GCCGTGGAGT-3) p-actin 正向 5:CCAGGAAAAGGTGT-GAAATC-3、反向 5:AAGCGCTTGGTGGTCAGATT-3：反 应条件:95丈 15 s,95T：10 s,60T： 5 s，72T：35 s，并扩 增40个循环。并使用2_A A e3法确定ULKl、Atgl3 mRNA的相对表达量。
1.3.5 细胞ULKl、Atgl3蛋白水平测定：收集肝癌 HePG2细胞，将所有细胞在冰上用裂解缓冲液裂解30 min，并将细胞碎片在4尤下离心，通过BCA蛋白法含 量测试盒检测蛋白质浓度。使用二烷基硫酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)将蛋白质在12V电压下 分离，而后将其印迹到PVDF膜上，在室温下用
5%脱 脂干乳液在5%牛血清白蛋白封闭膜2 h。将PVDF膜 与 ULK1、Atgl3 氺-actin—抗(稀释比 1:1 000)在 4^下 孵育24 h，在BSA中洗涤PVDF膜3次，持续10 min，在 37尤下将辣根过氧化物酶标记IgG二抗（稀释比1: 2 000)孵育1h，在BSA中洗涤PVDF膜3次，持续10 min。使用化学发光ECL测定试剂盒检测各蛋白质，使 用LAS3000型显影仪显亦Western印迹，通过Multigau-geV3.0软件应用图像分析检测蛋白质表达。
1.3.6 R0S检测：ROS水平通过2,7-二氯二氢荧光 素二乙酸酯（DCFH-DA)(Beyotime)测量。让96孔板 上的肝癌HePG2细胞附着过夜，然后用相应药物处理 24 h，除去培养基，用PBS洗涤3次，然后与DCFH-DA 在37丈下温育30 min，通过酶标仪测量488 nm激发 波长和525 nm发射波长的ROS水平。
1.4统计学方法采用SPSS 19. 0软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差(5 ±〇表示，多组比较采用单因素方差分析，多重比较 采用LSD-t检验。P<0. 05表示差异有统计学意义。2结果
2.1各组肝癌HePG2细胞OD值、存活率比较与肝癌HePG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A 低、高剂量组细胞OD值、存活率降低U/P= 15. 639/ 0.000,21. 547/0. 000,18. 541/0. 000,26. 324/0. 000, 18. 514/0.000、16. 852/0.000)；与 5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组细胞OD值、存活率升高 U/尸=21.214/0. 000、19.547/0. 000、18. 547/0. 000、25.478/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节 香附素A高剂量组细胞O D值、存活率降低（f/P = 16 •547/0.000、2
3.547/0 _000)，见表 1。
表1各组肝癌HePG2细胞O D值、存活率比较（i±s)组另t l
n O D值存活率（％)
肝癌HepG2细胞组60.93 ±0.0590.92 ±6.41
5-氣尿嘧啶组60.45 ±0. 18a39.41 ±9.42a
竹节香附素A低剂量组60.84+0.14a b78.85 ±5.32a b
竹节香附素A高剂暈组60.53 ±0.13ab c56.46 ±5.42ab c 广值18.29066.750
P值0.0000,000
注：与肝癌HePG2细胞组比较，< 0. 01 ；与5-氟尿嘧啶组比较,
<0.01；与竹节香附素A低剂量组比较< 0. 01
2.2各组肝癌HePG2细胞自噬小体水平比较与肝癌HePG2细胞组（6
3.54 ± 12. 54个）比较，5_氟尿嘧陡 组(598. 54 ± 15. 64个）、竹节香附素A低剂量组(290.47 ±17. 54 个）、高剂量组（483. 65 ±15.69 个) 自噬小体数升高（t/P= 10. 547/0. 000、16. 547/0. 000、20.547/0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A 低、高剂量组自噬小体数降低U/户=16. 325/0. 000、22. 547/0.000)；与竹节香附素A低剂量组比较，竹节 香附素A高剂量组自噬小体数升高（t/P = 15. 696/ 0.000)，见图 1。
2.3肝癌HePG2细胞凋亡率比较与肝癌HePG2细 胞组细胞凋亡率（0.90 ±0.24)%比较，5-氟尿嘧啶组 (10.80 ±0. 26)%、竹节香附素A低剂量组（2. 30 ± 0.23)%、高剂量组（9. 00 ± 0. 29)% 升高（t/i3 = 12. 321/0. 000、25. 547/0. 000、19. 541/0.000)；与 5-氟 尿嘧啶组比较，竹节香附素A低、高剂量组细胞凋亡 率降低（f/P=9. 874/0.000、16.589/0.000)；与竹节香 附素A低剂量组比较，竹节香附素A高剂量组细胞凋 亡率升高= 10. 654/0. 000)，见图 2。reactive oxygen species (ros)
2.4各组肝癌HepG2细胞ULK1、Atgl3 mRNA 表达
水平比较与肝癌HepG 2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组 及竹节香附素A 低、高剂量组细胞ULK 1、Atgl 3 mRNA 表达水平升高（f/P =25. 654/0. 000、15_ 987/0. 000、 23.547/0.000、18. 654/0. 000、18. 547/0. 000、16. 547/ 0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A 低、高剂 量组细胞ULK 1、Atgl 3 mRNA 表达水平降低（t/P = 13.654/0.000、14. 654/0. 000、16. 589/0. 000、21.247/ 0. 000)；与竹节香附素A 低剂量组比较，竹节香附素
A 高剂量组细胞ULK 1、Atgl 3 mRNA 表达水平升高〇/ P = 14. 697/0. 000、18. 324/0. 000)，见表 2。
表2
各组肝癌HePG 2细胞U L K 1、
A tg13 m R N A 表达水平比较
组另lj
n
ULK1Atgl3肝癌HepG 2细胞组60.86 ±0.140.80 ±0.135-氟尿嘧啶组
6 6.71 ±0.15a 5.54+0.173竹节香附素A 低剂量组6 2.42±0.10u b 2.43 ±0.23a b 竹节香附素A 高剂量组6
4.69 ±0.17 — 4.14 ±0.14—F 值1 949.690
859.450
户值
0.0000.000
注：与肝癌HePG 2细胞组比较，a P <0. 01；与5-M 尿嘧啶组比较，
V <0.01；与竹节香附素A
低剂量组比较,7 <0.01
2.5各组肝癌HepG 2细胞ULK 1、Atgl 3蛋白表达水 平比较与肝癌HePG 2细胞组比较,5-氟尿嘧陡组及 竹节香附素A 低、高剂量组细胞ULK 1、Atgl 3蛋白表 达水平升高 U //5 = 18. 741/0. 000、16. 547/0. 000、 17.548/0.000 J 6.547/0.000 J 5.847/0.000,20.478/
0.000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香附素A 低、高剂 量组细胞ULKl 、Atgl 3蛋白表达水平降低（MP = 21.687/0.000、18. 324/0. 000、18. 541/0. 000、19.587/ 0.000)；与竹节香附素A 低剂量组比较，竹节香附素
A 高剂量组细胞ULKl 、Atgl 3蛋白表达水平升高
U /f ^n .c ^v o .o o o j g j s v o .ooo )，见表 3、图 3。
表3
各组肝癌H e p G 2细胞U L K 1、
A tg13蛋白表达水平比较（.i w
，分)
组另
复孔数
U L K 1
A tg l 3
肝癌H epG 2细胞组6 1.29 ±0.54 1.13 ±0.485-氟尿嘧啶组
6 6.84±0.74a 6.98 ±0.45a 竹节香附素A 低剂暈组6 2.72±0.56ub 2.81 ±0.59ub 竹节香附素A 高剂量组6
4.85 ±0.59abc
5. 16 ±0.50abc F 值130.140154.240P 值
0.000
0.000
注：与肝癌HepG2细胞组比较<0. 01；与5-氟尿嘧啶组比较,
<0.01；与竹节香附素A
低剂量组比较< 〇. 01
A B C D
注:A .肝癌HePG 2细胞组;B. 5-氣尿嘧啶组;C.竹节香附素A 低剂 量组;U .竹节香附素A 高剂量绀图3
各组肝癌HePG 2细胞U L K 1、A tg l3 W e ste m -b lo t 电泳图
肝癌HePG 2细胞组
5-氟尿嘧啶组 竹节香附素A 低剂量组 竹节香附素A 高剂量组
图1
各组肝癌HePG 2细胞自噬小体图（吖啶橙染，x 400)
肝癌HePG 2细胞组 5-氟尿嘧啶组 竹节香附素A 低剂量组 竹节香附素A 高剂量组
图2各组肝癌HePG 2
细胞凋亡图
2.6各组肝癌HePG2细胞ROS水平比较与肝癌HepG2 细胞组 ROS水平（51 •08 ± 1. 13 )mol/ml 比较，5-氟尿嘧啶组（59. 89 ± 1.23)m〇l/ml、竹节香附素A低 剂量组（54.M ± 1.Z7)mol/ml、高剂量组（56. 56 ± 1.36) 升高（t/P = 1
3. 254/0. 000、18. 524/ 0. 000、16. 254/0. 000)；与5-氟尿嘧啶组比较，竹节香 附素A低、高剂量组ROS水平降低（f/P = 19. 654/ 0•000、2
4.052/0. 000)；与竹节香附素A低剂量组比 较，竹节香附素A高剂量组ROS水平升高（f/P = 18.547/0.000)〇
3讨论
竹节香附素A具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性。研究表明，竹节香附素A是Bcl-2蛋白表达的有效抑制剂，是各种肿瘤中抗凋亡蛋白的 抑制剂W。竹节香附素A在多种癌细胞系中诱导细 胞凋亡。在人类肺癌细胞中，竹节香附素A可以抑制 癌细胞迁移和入侵。竹节香附素A还可抑制炎性因 子核因子-k B(NF-k B)和激活蛋白-1(AP-1)，而肿瘤血 管生成与炎性反应密切相关；竹节香附素A也可抑制 肿瘤血管生成[1°]。这些结果表明，竹节香附素A可能 具有抗肿瘤的潜力。本研究发现，与肝癌HePG2 细胞组比较，5-氟尿嘧陡组及竹节香附素A低、高剂量 组OD值、存活率降低，细胞自噬小体、凋亡率水平升 高。这提示竹节香附素A能明显抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞自噬及凋亡。细胞凋亡和自噬是程序性 细胞死亡的2种重要类型。细胞凋亡被认为是杀死肿 瘤细胞的主要分子机制，其有2种信号通路，包括外源 和内源通路[11_14]。内在凋亡途径，也称为线粒体启动 途径，与细胞素C(Cyto-C)释放到细胞质有关，后者 激活下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，包括Atgl3，最终导致细胞凋亡。研究已发 现[15]，在胃癌细胞中，竹节香附素A通过激活Caspase 信号通路诱导胃癌细胞凋亡，这与本研究结果一致。
自噬是将细胞质材料递送至溶酶体以降解的过 程。超过30个基因参与自噬，其称为Atg。Atgl3是雷 帕霉素（TOR)激酶信号通路的靶点，通过Atgl3和 ULK1的磷酸化及ULK1/Atgl3复合物的调节来影响 自噬[16_19]。此外，近年来越来越多的证据表明，ULK1具有抗增殖活性。当ULK1用作肿瘤抑制因子表达 时，它主要定位于细胞质；当ULK1抑制上皮向间质转 化时，它会转导到细胞核中[2°]。数据表明，ULK
1通过 抑制增殖细胞核抗原（PCNA)蛋白来抑制食管组织细 胞核中的增殖。此外，ULK1通过P53依赖性途径在 肾上皮细胞（HEK293 )、人肝细胞癌细胞（HePG2 )和人乳腺癌（MDA-MB-231、MCF-73)中显示出显著的抗 增殖作用[2122]。在体外细胞研究中，CCK-8和细胞克 隆形成试验表明，过表达ULK1可以有效抑制A549和 H1299肺癌细胞的増殖。Atgl3是肿瘤抑制器和细胞 能量状态的传感器，在增殖和自噬中起重要作用。Atgl3可以被肝激酶B1、钙依赖性蛋白激酶(3及一些 小分子磷酸化和激活。活化的Atgl3与肿瘤的生长、侵袭和迁移密切相关。因此，Atgl3是一种正调节剂，可响应能量消耗刺激自噬。最近的研究表明，Atgl3 通过磷酸化和激活ULK1直接调节自噬。本研究结果 表明，激活肝癌HePG2细胞中的Atgl3，可抑制肝癌细 胞的增殖。ULK1/Atgl3复合物在ROS的调节和功能 中起作用。ROS通过Atgl3磷酸化自噬相关激酶ULK1来调节自噬。有证据表明ROS在自噬诱导中响 应各种细胞应激(包括葡萄糖饥饿）的作用[23]。ULK1是肿瘤抑制因子和细胞能量状态的传感器，它在增殖 和自噬中起重要作用,ULK1可被肝激酶B1，钙依赖性 蛋白激酶-(3和一些小分子磷酸化和激活，活化的 ULK1与癌细胞的肿瘤生长，侵袭和迁移密切相关「24261。因此，ULK1是一种正能调节因子，可以响应 能量消耗而刺激自噬。最近的研究表明，ULK1通过磷 酸化和激活BAX直接调节自噬。本结果显示，与肝癌 HepG2细胞组比较，5-氟尿嘧啶组及竹节香附素A低、高剂量组ULK1、At g13 mRNA和蛋白表达水平、ROS水 平升高。与上述讨论一致，说明竹节香附素A可促进 ULK1、Atgl3 mRNA和蛋白表达及ROS表达，进而激活 ULK1/Atgl3及HOS通路进而诱导肝癌细胞自噬。
综上所述，竹节香附素A能明显抑制肝癌细胞增 殖，促进肝癌细胞自噬及凋亡；其机制与竹节香附素A 可促进ULK1、At g13 mRNA和蛋白表达及ROS表达，激活ULK1/Atgl3及ROS通路有关。
利益冲突：所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
赵利：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；马向明：提 出研究思路，分析试验数据，论文审核；王瑛：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；吉瑞更：进行统计学分析；付庆江、曹立 瀛：课题设计，论文撰写
参考文献
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