天津医药2020年4月第48卷第4期
1,25-二羟维生素D3通过TGF-β1/（Smad2/3）影响的
ROS 调节气道重塑
张鹤，张沄，王宋平△
摘要：目的
探讨1，25-二羟维生素D3［1，25-（OH ）2D 3
］通过转化生长因子-β1（TGF-β1）/（Smad2/3）对活性氧（ROS ）的影响及调节气道重塑的分子机制。方法
选取健康雌性Balb/c 小鼠24只，随机分为正常组（A 组）、哮喘组
（B 组）、1，25-（OH ）2D 3+哮喘组（C 组）。B 组和C 组于第0、7、14天腹腔注射0.5mL 致敏液（10µg 卵清蛋白与2mg 铝制剂），之后用卵清蛋白雾化吸入，于第21~27天每天雾化1次，第28~77天隔天雾化1次制备小鼠支气管哮喘气道重塑模型。C 组在每次雾化激发前30min 予以腹腔注射100ng 1，25-
（OH ）2D 3，实验过程持续至少77d 。收集小鼠肺组织分别用于HE 染、AB-PAS 染、Masson 染分析小鼠气道病理形态改变、气道黏液高分泌及气道重塑，运用计算
机图像分析系统评价各组气道重塑情况。用免疫荧光检测气道ROS 的表达，Western blot 检测TGF-β1、Smad2/3的表达水平。结果
B 组较A 组气道受损明显，可见大量炎性细胞浸润，黏液分泌增加，上皮下胶原沉积明显增多，与B
组相比，C 组病理形态损伤表现明显缓解，但仍较A 组加重；B 组较A 组ROS ，TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达水平明显升高。与B 组相比，C 组ROS ，TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达降低，但仍较A 组升高（P ＜0.01）。结论1，25-（OH ）2D 3
可能通过抑制TGF-β1/（Smad2/3）的表达从而减少ROS 水平，达到调节小鼠气道重塑的作用。
关键词：骨化三醇；哮喘；气道重塑；活性氧；转化生长因子-β1；1,25-二羟维生素D3中图分类号：R562.25
文献标志码：A
DOI ：10.11958/20192502
Effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3on ROS regulating airway
remodeling through TGF-β1/(Smad2/3)
ZHANG He,ZHANG Yun,WANG Song-ping △
Department of Respiration,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,China △
Corresponding Author E-mail:*****************
Abstract:Objective
To explore the effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3［1,25-(OH)2D 3］on reactive oxygen species
(ROS)through transforming growth factor-β1(TGF-β1)/(Smad2/3)and molecular mechanism of regulating airway remodeling.Methods
Twenty-four healthy female Balb/c mice were randomized into control group (group A),asthma group
(group B),and asthma treated with 1,25-(OH)2D 3group (group C).The group B and group C were sens
itized with ovalbumin
via intraperitoneal injection at the day 0,7,and 14,and ovalbumin was also given by aerosol inhalation,once a day from the
day 21to 27,and once every other day from day 28to 77to build the airway remodeling model of bronchial asthma of mice.Group C was given 100ng of 1,25-(OH)2D 3via intraperitoneal injection half an hour before each aerosol challenge,and the experimental process lasted at least 77days.The lung tissues of mice were collected for HE staining,AB-PAS staining,and Masson staining to analyze the airway pathological changes,high secretion of airway mucus,and airway remodeling status.The computer image analysis system was used to evaluate the airway remodeling.Airway ROS expression was tested by immunofluorescence.The expression levels of TGF-β1and Smad2/3were tested with Western blot assay.Results Compared with group A,the airways was significantly damaged in group B with large amount of inflammatory cell infiltration,increased mucus secretion and increased subepithelial collagen deposition.Compared with group B,the pathological and morphological damages were significantly relieved in group C,but still more severe than those of group A.The expression levels of ROS,TGF-β1and Smad2/3proteins were significantly higher in group B than those in group A.Compared with
group B,the expressions of ROS,TGF-β1and Smad2/3proteins were reduced in group C,but still higher than those in group A (P ＜0.01).Conclusion
1,25-(OH)2D 3may reduce the ROS level by inhibiting the expressions of TGF-β1/
(Smad2/3),and thereby regulating the airway remodeling in mice.
基金项目：四川省卫计委课题资助项目（18PJ402）
作者单位：泸州市西南医科大学附属医院呼吸内一科（邮编646000）
作者简介：张鹤（1993），女，硕士研究生在读，主要从事呼吸系统疾病的临床研究
△
通信作者E-mail:*****************
实验研究
267
Tianjin Med J,April2020,Vol.48No.4 Key words：calcitriol;asthma;airway remodeling;reactive oxygen species(ROS);transforming growth factor-β1(TGF-β1);1,25-dihydroxyvitamin D3
支气管哮喘（哮喘）是由多种细胞和细胞组分参
与的以气道慢性炎症为特征的异质性疾病。氧化-
抗氧化机制失衡是支气管哮喘的发病机制之一［1］。
其中活性氧（ROS）可促进气道高反应、黏液高分泌
等，导致气道重塑［2-3］。转化生长因子-β1（TGF-β1）
通过诱导胶原蛋白的合成和成纤维细胞的增殖，导致
气道基底膜增厚，从而引起气道重塑［4］。而TGF-β1
同时具有调节多种细胞生长和分化等功能，可以刺激
细胞产生ROS，促进氧化应激反应，加速纤维化进
程［5-6］。近年来1，25-二羟维生素D3［1，25-（OH）2D3］在支气管哮喘方面的研究成为热点。相关研究表
明，1，25-（OH）2D3对哮喘的气道炎症及气道重塑有抑制作用，1，25-（OH）2D3可以通过抑制TGF-β1/Smads 通路，从而改善气道重塑［7］。同时1，25-（OH）2D3也具有抗氧化应激作用，通过减少ROS生成，调控哮喘气道氧化应激水平，从而达到抗炎和抗氧化作用［8］。但目前1，25-（OH）2D3对于支气管哮喘通过TGF-β1/（Smad2/3）通路调节ROS的机制尚不明确。本研究通过构造慢性哮喘小鼠模型，探讨1，25-（OH）2D3对哮喘小鼠气道重塑和对氧化应激的影响及其机制，以期为哮喘临床应用提供参考。
1资料与方法
1.1一般资料（1）实验动物。雌性SPF级Balb/c小鼠24只，周龄6～8周，体质量18～24g，购自重庆莱彼特生物科技有限公司，饲养于西南医科大学动物房，恒温25℃，清洁饲料喂养，自由饮食和饮水，12h昼夜交替。（2）主要药品与试剂。卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）购自美国Sigma公司，氢氧化铝粉剂购自成都市科隆化学品有限公司，1，25-（OH）2D3粉剂购自阿拉丁公司，无水乙醇购自成都市科隆化学品有限公司，自制密闭纸箱30cm×30cm×20cm，超声雾化器购自东莞市健宝电子科技有限公司，TGF-β1和Smad2/3抗体分别购自武汉三鹰公司和CST公司。
1.2哮喘模型的制备参照文献［9］，标准饲养1周后24只小鼠随机分为正常组（A组）、哮喘组（B组）、1，25-（OH）2D3+哮喘组（C组）。B组和C组分别于第0、7、14天腹腔注射0.5 mL致敏液（10µg卵清蛋白与2mg氢氧化铝制剂），而A组则注射等量的生理盐水。于第21天将B、C组小鼠分别置于封闭纸箱中，以
2.5%OVA溶液雾化30min，其中第21～27天每天雾化1次，第28～77天隔天雾化1次。而A组给予等量的生理盐水雾化。C组在第21天每次雾化激发前30min腹腔注射100ng1，25-（OH）2D3溶液。A组及B组给予等量的生理盐水进行腹腔注射。整个实验过程持续至少77d。
1.3肺组织病理形态检测各组小鼠于末次激发后24h内用麻醉并处死。取出右肺置于4%甲醛溶液中外固定48h，常规制备病理石蜡切片，用于HE、PAS染及Masson 染，免疫荧光检测小鼠气道ROS。
1.4气道重塑相关指标测量Masson染观察气道胶原沉积程度，运用计算机图像分析软件Image-Pro Plus测量气道胶原沉积的面积，分别测量支气管基底膜周径（Pbm）、气管内管壁面积（WAi）、平滑肌层面积（WAm），并用Pbm将测量值标准化，分别代表支气管内壁厚度（WAi/Pbm），平滑肌层厚度（WAm/Pbm），以衡量气道重塑程度。
1.5各组小鼠肺组织中ROS水平检测将小鼠处死后取出肺组织，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）稍洗，冷冻，
将冷冻后的肺组织用冰冻切片机，切片。制片后，滴加稀释好的探针溶液，
37℃孵育30min，PBS洗去多余探针溶液，抗体孵育后用二脒基苯基吲哚（DAPI）染，用抗荧光淬灭剂封片，用荧光显微镜（×200）观察并拍照。
1.6肺组织中TGF-β1及Smad2/3的表达提取小鼠肺组织匀浆总蛋白，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，采用SDS-PAGE、转膜、抗体孵育、化学发光。检测肺组织中TGF-β1及Smad2/3的表达。
1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnett-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肺组织病理形态改变
2.1.1HE染A组小鼠可见气道上皮结构完整，未见明显破坏。B组可见大量炎性细胞，气道管腔分泌物，支气管壁增厚，支气管平滑肌肥大，黏膜下水肿。C组小鼠气道上皮结构相对完整，仍可见少许气道上皮脱落，病理改变较B组减轻。见图1。2.1.2PAS染A组小鼠气道上皮结构完整，未见支气管上皮
杯状细胞，气道管腔光滑，未见黏液分泌；与A组比较，B组小鼠支气管上皮杯状细胞增生，黏液分泌增加，部分管腔黏液栓形成，PAS染阳性细胞数明显增加；C组较B组支气管上皮杯状细胞增生及黏液分泌减少，PAS染阳性细胞数减少，但较A组增多，见图2。
2.1.3Masson染A组气管腔气道上皮光滑，气道上皮有少许胶原沉积，B组气道上皮下胶原沉积明显增多，病理改变明显，而C组较B组上述改变减轻，但仍较A组多，见图3。
2.1.4各组胶原沉积面积、壁厚度和平滑肌厚度比较与A组比较，B组胶原沉积面积比、支气管管壁
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天津医药2020年4月第48卷第4期
厚度和平滑肌厚度明显增加，C组胶原沉积面积比、管壁厚度和平滑肌厚度较B组减少，但仍较A组增加（P＜0.05），见表1。
2.2各组肺组织ROS、TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达水平比较正常情况下，A组细胞中产生低水平的ROS，TGF-β1、Smad2/3蛋白也呈低表达，B组较A 组ROS、TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达水平明显升高；与B组相比，C组ROS，TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达降低，但仍较A组升高（P＜0.05），见图4、
5，表2。
3讨论
1，25-（OH）2D3是体内最重要的维生素D的活
性代谢产物，可通过参与先天性免疫过程和适应性免疫过程发挥抗炎、免疫调节等作用［10］。Kim 等［11-12］发现，1，25-（OH）2D3可能通过调控RhoA/Rho 激酶信号通路、抑制核因子-κB（NF-κB）、TGF-β1/ Smads通路调节哮喘等过敏性疾病。1，25-（OH）2D3
不仅具有抗炎的作用，也可通过减少ROS生成调控氧化应激水平，从而达到抗氧化作用［13］。但目前1，25-（OH）2D3对于哮喘小鼠通过TGF-β1/（Smad2/3）调节ROS的机制少有报道。
本研究结果显示，与哮喘组比较，给予1，25-（OH）2D3后气道炎性细胞及管腔分泌物明显减少，气道上皮结构相对完整，胶原纤维沉积减少，ROS免疫荧光强度降低，TGF-β1及Smad2/3表达减少，提示1，25-（OH）2D3可改善支气管哮喘气道炎症、气道重塑及氧化应激水平。TGF-β1/Smads通路是哮喘发病机制中主要的信号转导通路，在哮喘气道重塑中起关键作用，可通过调节细胞的增殖、分化、凋亡、纤维化等，影响胶原沉积及纤维化的形成，增加小气道狭窄［14-15］。本研究结果显示，哮喘状态下小鼠的TGF-β1和Smad2/3表达明显增加，而1，25-（OH）2D3后，TGF-β1和Smad2/3的表
达减少，提示1，25-（OH）2D3能在一定程度上抑制TGF-β1和Smad2/3的表达，表明1，25-（OH）2D3调控哮喘气道重塑的机制可能是通过抑制TGF-β1/（Smad2/3）通路实现的。氧化应激参与哮喘发生发展过程，而ROS可直接作用并破坏细胞，导致细胞功能障碍或细胞死亡等，促进炎症反应，并且进一步促进气道高反应、黏液高分泌及纤维化［16］。另外本研究显示，哮喘状态下小鼠的ROS表达明显增加，而1，25-（OH）2D3后，ROS的表达减少，提示1，25-（OH）2D3能在一定程度上抑制ROS的表达，表明1，25-（OH）2D3可能通过抑制ROS的表达从而抑制氧化应激反应。Demir等［17］也证实，1，25-（OH）2D3可以抑制ROS的表达，从而抑制氧化应激反应。TGF-β1参与包括哮喘在内的多种气道慢性炎症疾病，可通过多种机制促进哮喘气道重塑，其中包括刺激肺泡上皮细胞、内皮细胞等合成ROS［18］。ROS是诱导纤维化的重要介质，能够促进胶原蛋白的合成，是TGF-β1和Smad2/3作用于纤维化的细胞内信号转导介质，其能够通过激活TGF-β1/（Smad2/3）通路，从而进一步促进气道重塑［19］。本研究结果显示，哮喘状态下小鼠TGF-β1和ROS表达均明显升高，这与Tyagi等［20］研究结果一致，提示TGF-β1可刺激细胞产生ROS，促进氧化应激反应，加速纤维化进程，考虑原因可能为TGF-β1能够通过上调尼克
组别A组B组C组F 胶原沉积面积比
（%）
4.480±0.842
28.047±3.265a
11.590±1.915ab
87.450＊＊
支气管壁厚度
（µm）
9.190±0.416
25.780±0.947a
12.637±1.102ab
302.055＊＊
平滑肌厚度
（µm）
3.407±0.487
8.993±0.496a
5.937±0.520ab
93.473＊＊
Tab.1comparison of bronchial wall thickness,smooth muscle thickness and collagen deposition
area ratio between three groups
表13组支气管胶原沉积面积比、管壁厚度和
平滑肌厚度比较（n=3，x±s）＊＊P＜0.01，a与A组比较，b与B组比较，P＜0.05
A B C
TGF-β1
Smad2/3
GAPDH
A：正常组；B：哮喘组；C：1，25-（OH）2D3+哮喘组Fig.5The electroporesis of TGF-β1and smad2/3protein
expressions in lung tissues of mice in three groups
图53组小鼠肺组织中TGF-β1和Smad2/3蛋白表达电泳图
组别A组B组C组F
TGF-β1
0.030±0.009
0.240±0.011a
0.097±0.013ab
263.218＊＊
Smad2/3
0.124±0.005
0.792±0.009a
0.347±0.067ab
227.945＊＊
ROS
41.547±3.490
89.867±3.070a
70.493±5.250ab
108.096＊＊
Tab.2Comparison of TGF-β1,Smad2/3and ROS
expressions between three groups
表23组TGF-β1、Smad2/3及ROS表达比较（n=3，x±s）
＊＊P＜0.01；a与A组比较，b与B组比较，P＜0.05
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酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）的活性，
增强细胞内ROS的合成，促进氧化应激反应，使气道
反应性升高，黏液分泌增高，血管通透性增加，进而加
速器官纤维化，促进气道重塑［21］。而1，25-（OH）2D3后，TGF-β1和ROS的表达减少，提示1，25-
（OH）2D3能够在一定程度上抑制TGF-β1和ROS的表达，表明1，25-（OH）2D3可能通过抑制TGF-β1的表达，从而下调ROS，达到抑制哮喘气道重塑及氧化应激水平的作用。
综上所述，1，25-（OH）2D3可以抑制哮喘气道重塑及氧化应激水平。同时，1，25-（OH）2D3可能通过抑制TGF-β1/（Smad2/3）的表达，从而减少ROS水平，达到调节小鼠气道重塑及氧化应激的作用。但相关机制尚未完全明确，还需进一步完善实验明确具体机制。
（图1～4见插页）
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（2019-08-16收稿2019-11-21修回）
（本文编辑陆荣展）
270
A
DAPI
ROS
Merge
B
C
A ：正常组；
B ：哮喘组；
C ：1，25-二羟维生素D3+哮喘组；用DAPI 进行细胞核染呈蓝，免疫荧光检测细胞内ROS 阳性表达（红表示），叠
加后可见ROS 与细胞核重叠
Fig.4
Representative immunofluorescence staining images of ROS in lung tissues of mice in three groups (×200)
图4
3组小鼠肺组织免疫荧光染ROS 图像（×200）
1,25-二羟维生素D3通过TGF-β1/（Smad2/3）影响的
ROS 调节气道重塑
（正文见267页）
A ：正常组
B ：哮喘组
C ：1，25-（OH ）2
D 3+哮喘组
Fig.1Representative HE staining images of lung tissues of mice in three groups (×200)
图1
3组小鼠肺组织病理形态HE 染图像（×200）
Fig.3
Representative Masson staining images of lung tissues of mice in three groups (×200)reactive oxygen species (ros)
图33组小鼠肺组织Masson 形态染图像（×200）
A ：正常组
B ：哮喘组
C ：1，25-（OH ）2
D 3+哮喘组
Fig.2Representative PAS staining images of lung tissues of mice in three groups (×200)
图23组小鼠肺组织病理形态PAS 染图像（×200）
A ：正常组
B ：哮喘组
C ：1，25-（OH ）2
D 3+哮喘组

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