第48卷第3期2022年5月吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.48No.3
May2022
DOI：10.13481/j.1671‑587X.20220316
木犀草素抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号通路激活对小鼠急性
呼吸窘迫综合征的改善作用
曲海新1，袁二伟1，郭卫平2，张雅静1，马文霞2，吴丹1
（1.河北北方学院附属第一医院新生儿科，河北张家口075000；
2.河北北方学院附属第一医院儿科，河北张家口075000）
［摘要］目的
目的：探讨木犀草素调控活性氧（ROS）/硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）/NOD样受体相关蛋白3（NLRP3）信号通路激活对小鼠急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的改善作用。方法
方法：60只SD小鼠随机分为对照组、模型组、木犀草素（20mg·kg－1）组、邻苯三酚（PG）（75mg·kg－1）组和木犀草素（20mg·kg－1）+PG（75mg·kg－1）组，每组12只。除对照组外，其他组小鼠采用气管滴注脂多糖（LPS）溶液的方法建立ARDS模型，对照组小鼠气管滴注等量生理盐水。称量各组小鼠右肺湿质量和干质量，并计算湿质量/干质量（W/D）比值，检测各组小鼠动脉血氧分压（PaO2），HE 染观察各组小鼠肺组织病理形态表现，检测各组小鼠吸气阻力（Ri）、每分钟通气量（MV）和呼气峰流速（PEF），检测各组小鼠肺组织中ROS、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）水平及血清白细胞介素18（IL-18）、白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，Western blotting法检测各组小鼠肺组织中TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3蛋白表达水平。
结果
结果：与对照组比较，模型组小鼠肺泡壁变厚，肺泡塌陷变形，肺间质水肿伴有大量炎性细胞浸润，肺组织有严重病理损伤，W/D比值，Ri，血清IL-18、IL-1β及TNF-α水平，肺组织中ROS水平及TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3蛋白表达水平升高（P<0.05）；MV、PEF、PaO2和肺组织中GSH-Px
及CAT水平降低（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素组小鼠肺组织病理损伤均有所改善，W/D比值，Ri，血清IL-18、IL-1β及TNF-α水平，肺组织中ROS水平和TXNIP、caspase-1、caspase-4及NLRP3蛋白表达水平均降低（P<0.05），MV、PEF和PaO2及肺组织中GSH-Px和CAT水平均升高（P<0.05）；PG组小鼠肺组织病理损伤均加重，W/D比值，Ri，血清IL-18、IL-1β及TNF-α水平，肺组织中ROS水平及TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3蛋白表达水平均升高（P<0.05），MV、PEF和PaO2及肺组织中GSH-Px和CAT水平均降低（P<0.05）。结论
结论：木犀草素可通过抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号通路激活，减轻肺部炎症与氧化应激，改善ARDS小鼠肺损伤，修复其肺功能。
［关键词］木犀草素；活性氧；硫氧还蛋白结合蛋白；NOD样受体相关蛋白3；急性呼吸窘迫综合征［中图分类号］R563.8［文献标志码］A
Improvement effect of luteolin on acute respiratory distress
syndrome by inhibiting ROS/TXNIP/NLRP3signaling
pathway activation in mice
QU Haixin1,YUAN Erwei1,GUO Weiping2,ZHANG Yajing1,MA Wenxia2,WU Dan1（1.Department of N
eonatology，First Affiliated Hospital，Hebei North University，Zhangjiakou075000，[文章编号]1671‑587X(2022)03‑0676‑08
[收稿日期]2021‑08‑13
[基金项目]河北省卫健委医学科学研究课题计划项目（20211818）
[作者简介]曲海新（1987－），女，河北省承德市人，主治医师，医学硕士，从事新生儿疾病的诊断和方面的研究。
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曲海新，等.木犀草素抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号激活对小鼠急性呼吸窘迫综合征的改善作用China；2.Department of Pediatrics，First Affiliated Hospital，Hebei North University，
Zhangjiakou075000，China）
ABSTRACT Objective：To investigate the improvement effect of luteolin in the mice with acute respiratory distress syndrome（ARDS）by regulating the activation of reactive oxygen species（ROS）/thioredoxin binding protein（TXNIP）/NOD like receptor associated protein3（NLRP3）sign
aling pathway. Methods：A total of60SD mice were randomly divided into control group，model group，luteolin （20mg·kg－1）group，pyrogallol（PG）（75mg·kg－1）group，luteolin（20mg·kg－1）+PG（75mg·kg－1）group，and there were12mice in each group.Besides control group，the mice in the other groups were instilled with lipopolysaccharide（LPS）solution through the trachea to establish the ARDS models，and the mice in control group were instilled with the same amount of normal saline through the trachea.The wet weights and dry weights of right lung tissue of the mice in various groups were weighed，and ratios of the wet weight/dry weight（W/D）of the mice in various were caculated；the arterial blood oxygen pressure （PaO2）was measured；the pathomorphology of lung tissue of the mice in various groups was observed by HE staining；the inspiratory resistance（Ri），minute ventilation（MV）and peak expiratory flow rate （PEF）of the mice in various groups were detected；the levels of ROS，glutathione peroxidase（GSH-Px），catalase（CAT）in lung tissue and levels of serum interleukin-18（IL-18），interleukin-1β（IL-1β）and tumor necrosis factorα（TNF-α）of the mice in various groups were determined；the expression levels of TXNIP，caspase-1，caspase-4and NLRP3proteins in lung tissue of the mice in various groups were detected by Western blotting method.Results：Compared with control group，the alveolar walls of the mice in model group became thicker，the alveoli collapsed and deformed，the pulmonary interstitial edema was accompanied by a large number of inflammatory cell infiltration，and the lung tissue had the seve
re pathological damage；the W/D ratio，Ri，serum IL-18，IL-1βand TNF-αlevels，the level of ROS and the expression levels of TXNIP，caspase-1，caspase-4，and NLRP3proteins in lung tissue were increased（P< 0.05），and the MV，PEF，PaO2，levels of GSH-Px and CAT in lung tissue were decreased（P<0.05）. Compared with model group，the pathological damage of lung tissue of the mice in luteolin group was improved，the W/D ratio，Ri，serum IL-18，IL-1βand TNF-αlevels，ROS level and the expression levels of TXNIP，caspase-1，caspase-4and NLRP3proteins in lung tissue were significantly decreased（P< 0.05），and the MV，PEF，PaO2，and GSH-Px and CAT levels in lung tissue were increased（P<0.05）；the pathological damage of lung tissue of the mice in PG group was increased，the W/D ratio，Ri，serum levels of IL-18，IL-1β，and TNF-α，the ROS level and the expression levels of TXNIP，caspase-1，caspase-4，and NLRP3proteins in lung tissue were increased（P<0.05），and the MV，PEF，PaO2，GSH-Px，and CAT levels in lung tissue were decreased（P<0.05）.Conclusion：Luteolin can reduce the lung inflammation and oxidative stress，improve the lung injury in the ARDS mice，and repair their lung functions by inhibiting the ROS/TXNIP/NLRP3signaling pathway activation.
KEYWORDS Luteolin；Reactive oxygen species；Thioredoxin-binding protein；NOD-like receptor pyrin domain containing3；Acute respiratory distress syndrome
急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是常见的肺部炎性疾病，肺部感染、创伤和脓毒症等是ARDS的主要致病因素，其临床特征为低氧血症、肺水肿及进行性等，是造成重症监护室患者死亡的重要原因［1-2］。肺实质弥漫性炎症和强烈的氧化应激是ARDS的主要发病机制，减轻炎症并降低氧化应激水平是其有效的策略［3-4］。木犀草素是一种具有较强抗菌、抗氧化和抗炎等药理活性的天然黄酮类化合物，广泛存在于木犀草、黄芩、紫苏和金银花等药材中，可上调抗氧化基因的表达，通过抗炎及抗氧化作用减轻脓毒症诱导的急性肺损伤［5］，木
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犀草素还是ARDS的中药方剂清肺承气汤的重要起效成分［6］，因而推测木犀草素对ARDS可能有很好的防治作用。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein3，NLRP3）炎症小体作为引发炎症的重要信号分子，在各种肺部疾病的发生发展中起着重要调控作用，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和硫氧还蛋白结合蛋白（thioredoxin binding protein，TXNIP）是NLRP3上游调节分子，降低其表达水平，可抑制NLRP3信号激活，减轻炎症，改善肺组织损伤，因而ROS/TXNIP/NLRP3信号能作为ARDS的重要靶点［7-9］。本研究构建ARDS小鼠模型，探讨木犀草素调控ROS/TXNIP/NLRP3信号通路对ARDS 小鼠的保护作用，为ARDS的提供依据。
1材料与方法
1.1实验动物
实验动物、、主要试剂和仪器BALB/c雄性小鼠购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（豫）2020－0005，SPF 级，体质量为20~22g。分笼饲养于本院动物中心，动物房温度为21℃~25℃，相对湿度为50%~55%，照明12h/12h明暗交替循环，动物实验符合3R原则。木犀草素（批号724C021）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（批号320V0319）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性检测试剂盒、HE染试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（PC0020）、小鼠白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒、高效RIPA裂解液（R0010）、小鼠白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）ELISA试剂盒和小鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（SEKM-0034）购自北京索莱宝科技有限公司，组织ROS检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，邻苯三酚（pyrogallol，PG）购自美国Selleck公司，兔源GAPDH一抗、兔源NLRP3一抗、兔源caspase-1一抗、兔源caspase-4一抗、兔源TXNIP一抗和羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。动物血气分析仪（型号GEM3500）购自上海玉研科学仪器有限公司，肺功能检测仪（型号S-980A I）购自四川思科达科技有限公司，电子天平（型号BSA224S-CW）购自德国Sartorius公司，酶标仪（型号Spectra Max M2/
M2e）购自美国Molecular device公司，倒置荧光显微镜（型号DMI3000B）和冰冻切片机（型号CM3050S）购自德国Leica公司，多样品组织匀浆机（型号Tissuelyser-192）购自上海净信公司，垂直电泳槽（型号VE180）、转移电泳槽（型号VE 186）和电泳仪（型号EPS300）购自上海天能科技有限公司，凝胶成像仪（型号ChemiDoc XRS＋）购自美国Bio-Rad公司。
1.2ARDS小鼠模型制备和动物分组ARDS模型制备方法参考文献［10］：将LPS加入0.9%氯化钠溶液中溶解混匀配置为4.3mg·kg－1，向小鼠气管中滴注LPS溶液，翻转小鼠并抬起其头颅，使药液均匀进入其两肺中，约6h后观察小鼠行为，若其出现精神萎靡不振，食欲减退，少动，呼吸急促等症状，提示ARDS模型构建成功。将模型小鼠随机分为模型组、木犀草素组、PG组和木犀草素+PG组，每组12只；另选出12只小鼠作为对照组，给予气管滴注等量生理盐水。将木犀草素和PG加入生理盐水中溶解混匀，分别制成2g·L－1木犀草素［11］药液、7.5g·L－1PG［12］溶液、木犀草素（2g·L－1）及PG（7.5g·L－1）的混合药液，药物干预组小鼠以10mL·kg－1木犀草素药液、PG溶液、木犀草素及PG的混合药液分组腹腔注射，使木犀草素的剂量达到20mg·kg－1，PG的剂量达到75mg·kg－1，模型组和对照组小鼠均腹腔注射10mL·kg－1生理盐水，每天注射1次，共进行5d。
1.3各组小鼠肺功能检测和标本收集各组小鼠于药物处理结束后24h，以小动物肺功能检测仪测定呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF）、吸气阻力（resistance inspiratory，Ri）和每分钟通气量（minute ventilation，MV）值，作为评判小鼠肺功能的指标。然后颈椎脱臼处死小鼠，自颈动脉取血1.3mL，取0.
6mL血进行动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）检测，剩余血液经离心后，吸出上清保存于－80℃环境中；小鼠开胸取出双肺，右肺组织行湿质量／干质量（wet weight/dry weight，W／D）比值测定，左肺组织中剪下约0.9g组织保存于液氮中，再剪下0.3g组织采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液，剩余肺组织漂洗后，浸没在包埋剂中，以液氮快速冰冻成块后，采用冰冻切片机做常规病理切片备用。
1.4各组小鼠PaO2和肺W/D比值的检测将“1.3”步骤中的小鼠动脉血置于小动物血气分析仪
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曲海新，等.木犀草素抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号激活对小鼠急性呼吸窘迫综合征的改善作用
中，测定其PaO2值。称量“1.3”步骤中的小鼠右肺湿质量，然后置入烘烤箱中脱水，称量其干质量，计算W/D比值。
1.5各组小鼠肺组织病理形态表现观察取出“1.3”步骤中的肺组织冰冻切片，复温后，浸入冰丙酮中固定，采用试剂盒参照其说明书行HE染，蒸馏水漂洗后切片，采用显微镜观察各组小鼠肺组织病理形态表现并拍照，每张切片任意采集5个视野。
1.6各组小鼠肺组织中ROS、GSH-Px、CAT水平及血清IL-18、IL-1β、TNF-α水平检测取“1.3”步骤中制
备的各组小鼠肺组织单细胞悬液，根据ROS测定试剂盒说明书步骤检测肺组织中ROS水平。取出“1.3”步骤中保存在液氮中的肺组织，置于高效RIPA裂解液中，通过组织匀浆机制备成匀浆液，4℃离心后采用BCA法检测其蛋白总浓度，取出0.1mL，采用试剂盒参照其说明书步骤检测肺组织中GSH-Px及CAT水平。取出“1.3”步骤中保存在－80℃中的血清，以冰水浴提取解冻后，采用试剂盒参照其说明书步骤检测血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平。
1.7各组小鼠肺组织中TXNIP/NLRP3通路相关蛋白TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3表达水平检测取肺组织蛋白样品液，100℃煮沸5min，蛋白变性后，各组取20µg总蛋白，于120V恒压下电泳1h，使蛋白分离后，通过湿转（40mA、75min）将其转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉溶液室温孵育1.5h，以薄刀片将目的蛋白TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3自膜上裁下，以相对应的兔源一抗孵育（4℃、10h），TBST洗膜（3次、每次5min），以羊抗兔二抗孵育（室温、1.5h），洗膜（3次、每次5min，TBST），ECL 显，拍照后采用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。
1.8统计学分析采用SPSS24.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠MV、PEF、Ri、W/D比值和PaO2，血清IL-18、IL-1β和TNF-α水平，肺组织中GSH-Px、CAT和ROS水平及TXNIP、caspase-1、caspase-4和NLRP3蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组小鼠MV、PEF和Ri与对照组比较，模型组小鼠MV和PEF均降低（P<0.05），Ri升高（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素组小鼠MV 及PEF升高（P<0.05），Ri降低（P<0.05）；与模型组比较，PG组小鼠MV和PEF降低（P< 0.05），Ri升高（P<0.05）；与PG组比较，木犀草素+PG组小鼠MV和PEF升高（P<0.05），Ri降低（P<0.05）；与木犀草素组比较，木犀草素组小鼠MV和PEF降低（P<0.05），Ri升高（P< 0.05）。见表1。
2.2各组小鼠W/D比值和PaO2与对照组比较，模型组小鼠W/D比值升高（P<0.05），PaO2降低（P<0.05）。与模型组比较，木犀草素组小鼠W/D 比值降低（P<0.05），PaO2升高（P<0.05）；PG组小鼠W/D比值升高（P<0.05），PaO2降低（P< 0.05）。见表2。
2.3各组小鼠肺组织病理形态学表现对照组小鼠肺泡结构清晰完好，肺间质无水肿和炎性细胞浸
表1各组小鼠MV、PEF和Ri
Tab
Tab..1MV
MV,,PEF
PEF,,and Ri of mice in various groups
(n=12，x±s）Group
Control
Model
PG
Luteolin
Luteolin+PG
MV（V/mL）
7.71±0.68
2.82±0.35*
1.15±0.13△
7.66±0.74△
2.85±0.42#○
PEF（mL·s－1）
62.45±6.56
39.38±3.43*
20.84±2.12△
62.17±6.26△
39.42±3.78#○
Ri（kPa.s·L－1）
25.05±2.52
60.13±6.68*
79.85±7.18△
25.21±2.63△
59.98±7.04#○
*P<0.05vs control group；△P<0.05vs model group；#P<0.05 vs PG group；○P<0.05vs luteolin group.
表2各组小鼠W/D比值和PaO2
Tab
Tab..2W/D ratios and PaO2of mice in various groups
(n=12，x±s）Group
Control
Model
PG
Luteolin
Luteolin+PG
W/D
4.42±0.39
6.78±0.56*
8.65±0.61△
4.55±0.33△
6.74±0.70#○
PaO2（P/mmHg）
98.79±9.67
55.86±4.18*
37.08±3.27△
98.57±10.23△
56.01±6.24#○
*P<0.05vs control group；△P<0.05vs model group；#P<0.05 vs PG group；○P<0.05vs luteolin group.
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吉林大学学报（医学版）润，肺组织无损伤；模型组小鼠肺泡壁变厚，肺泡塌陷变形，肺间质水肿伴有大量炎性细胞浸润，肺组织有严重病理损伤；与模型组和木犀草素+PG 组
比较，木犀草素组小鼠上述肺组织损伤均明显改善；PG 组小鼠上述肺组织损伤均明显加重。见图1。
2.4各组小鼠肺组织中GSH -Px 和CAT 水平与
对照组比较，模型组小鼠肺组织中GSH -Px 和CAT 水平降低（P <0.05）。与模型组比较，木犀草素组
小鼠肺组织中GSH -Px 和CAT 水平均升高（P <0.05），PG 组小鼠肺组织中GSH -Px 和CAT 水平均降低（P <0.05）。见表3。
2.5
各组小鼠血清IL -18、IL -1β和TNF -α水平与对照组比较，模型组小鼠血清IL -18、IL -1β和TNF -α水平均升高（P <0.05）。与模型组比较，
木犀草素组小鼠血清IL -18、IL -1β和TNF -α水平均降低（P <0.05），PG 组小鼠血清IL -18、IL -1β和TNF -α水平均升高（P <0.05）。见表4。
2.6各组小鼠肺组织中ROS 水平和TXNIP 、
caspase -1、caspase -4及NLRP3蛋白表达水平
与
对照组比较，模型组小鼠肺组织中ROS 水平和TXNIP 、caspase -1、caspase -4及NLRP3蛋白表达水平均升高（P <0.05）。与模型组比较，木犀
草
A ：Control group ；
B ：Model group ；
C ：PG group ；
D ：Luteolin group ；
E ：Luteolin +PG group.
图1
各组小鼠肺组织病理形态表现（HE,×400）
Fig.1
Pathomorphology of lung tissue of mice in various groups (HE,×400)
表3
各组小鼠肺组织中GSH -Px 和CAT 水平
Tab Tab..3
Levels of GSH -Px and CAT in lung tissue of mice in
various groups
[n =12，x ±s ，λB /（U ·mg －1）］
Group Control Model PG Luteolin Luteolin+PG
GSH -Px 20.09±3.459.86±1.06*6.12±1.39△19.97±3.27△9.90±1.25#○
CAT 5.13±0.322.61±0.15*1.02±0.23△5.09±0.51△2.64±0.18#○
*
P <0.05vs control group ；△P <0.05vs model group ；#
P <0.05
vs PG group ；○
P <0.05vs luteolin group.
表4各组小鼠血清IL -18、IL -1β和TNF -α水平
Tab Tab..4
Levels of serum IL -1818,,IL -1β,and TNF -αof mice
in various groups
(n =12，x ±s ）
Group Control Model PG Luteolin Luteolin+PG
IL -18[ρB /（μg ·L －1）]0.32±0.071.15±0.18*1.90±0.23△0.33±0.08△1.13±0.24#○
IL -1β[ρB /（ng ·L －1）]21.93±4.8167.41±9.32*98.72±11.48△22.01±5.84△67.37±10.56#○
TNF -α[ρB /（μg ·L －1）]0.42±0.101.47±0.28*2.30±0.32△0.44±0.11△1.45±0.23#○
*
P <0.05vs control group ；△P <0.05vs model group ；#P <0.05
reactive oxygen species (ros)vs luteolin+PG group ；○
P <0.05vs luteolin group.
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