ＮＡＤＰＨ氧化酶4在高糖促进ＨＵＶＥＣｓ内活性氧产生机制中的作用
目的：研究在高浓度葡萄糖刺激状态下，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）内活性氧的主要来源。方法：Ⅱ型胶原酶消化法分离培养人脐静脉内皮细胞，流式细胞术检测细胞内活性氧的生成，RT-PCR及Western blot检测细胞内NADPH氧化酶4（NOX4）的表达。结果：高糖处理HUVECs后细胞内ROS升高、NOX4表达明显上调；NOX抑制剂DPI能够抑制NOX4表达的上调和细胞内ROS的升高。结论：高糖处理HUVECs时细胞内ROS升高主要来源于NOX4。
[Abstract] Objective: To study the main source of ROS generated in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) while stimulated by high concentration of glucose.Methods:Human umbilical vein endothelial cells was isolated by type Ⅱ collagenase, Intracellular ROS generation was measured by flow cytometry, NOX4 expression in HUVECs was detected by RT-PCR and Western blot.Results:High concentration of glucose could increase ROS generation and NOX4 expression; DPI, the specially inhibitor of NADPH oxidase, could attenuated these effects. Conclusion:NOX4 was the main source of ROS generation in HUVECs cultured with high concentration of glucose.
[Key words] Glucose;HUVECs;ROS;NOX4
动脉粥样硬化是糖尿病的严重并发症之一，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的始动因素。因此，降低细胞内活性氧的水平是保护内皮细胞功能完整性及防治糖尿病并发动脉粥样硬化的关键途径之一[1]。在高水平葡萄糖状态下，内皮细胞功能失调，其中氧化应激起重要作用。氧化应激指的是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生大于机体的清除速率而在体内蓄积的状态。
内皮细胞内参与ROS产生的酶体主要有NADPH氧化酶(nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)、黄嘌呤氧化酶、线粒体电子传递链、不耦联的一氧化氮合酶等[2]，其中NOX可能是血管内皮细胞中ROS的主要来源。内皮细胞中主要表达NOX家族中的NOX4[3]。据文献报道[4,5]，在高葡萄糖刺激条件下，内皮细胞中ROS生成增加，并可导致细胞凋亡，但这是否与NOX4相关尚不清楚。本实验用高浓度葡萄糖处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，并给予NOX的抑制剂DPI预处理，以甘露醇为高渗对照，用流式细胞仪检测细胞内ROS的产生，以探讨ROS产生的主要來源，并观察NOX4 mRNA及蛋白的表达水平。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂新鲜脐带来自常德职业技术学院附属医院；M199培养基、Ⅱ型胶原酶、DPI、Trizol、反转录试剂盒为Invitrogen产品；胎牛血清购自Hyclone；DCFH－DA荧光探针购自江苏碧云天公司；葡萄糖、甘露醇为北京化学试剂公司产品；PCR引物为赛百盛合成；NOX4抗体购自Santa Cruz。
1.1.2主要仪器凝胶成像系统为Pharmacia Biotech产品，流式细胞仪型号为Becton Dickinson，型号FACS Calibur，Western－blot电泳系统为BIO-RAD公司产品。
1.2实验方法
1.2.1实验分组第一组为对照组，给予正常培养基培养；第二组为甘露醇高渗对照组，第三组为高葡萄糖处理组，给予20 mmol/L葡萄糖处理24 h；第四组为干预组，先给予DPI预处理0.5 h，再给予20 mmol/L葡萄糖处理24 h。
1.2.2原代HUVECs的分离培养取无菌新鲜脐带，用生理盐水冲洗脐静脉，然后用0.1%的Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉15 min，收集灌注液，800转/ min离心6 min，收集内皮细胞到培养瓶中加入20%胎牛血清的M199混合培养基在37℃含5%的CO2培养箱中培养，12 h后更换新鲜培养基。以后每隔2 d换液1次，待第2、3代细胞长至亚融合状态时用于实验。
1.2.3以DCFH-DA为荧光探针流式细胞仪检测细胞内ROS水平按照实验要求处理好细胞，用无血清的培养基冲洗细胞两次，加2 ml无血清培养基和4 μl DCFH-DA到25 cm2的培养瓶中，在37℃含5%CO2的培养箱中孵育30 min。PBS洗3次，胰酶消化，加血清终止反应，无血清培养基洗涤两次，用0.5 ml无血清培养基重悬细胞，300目尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞内ROS。其中阳性对照组加阳物（试剂盒提供）0.25 μl孵育30 min然后上机检测。(柱形统计图以正常对照组平均荧光值为基准，设为100，各组平均荧光值与正常组的比值为纵坐标，横坐标为实验分组)
1.2.4反转录聚合酶链反应检测HUVECs内NOX4表达按Invitrogen公司的Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA，逆转录反应按照Promega公司试剂盒的实验程序完成。PCR引物序列：β-actin 5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’和5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TT
C-3’，扩增片段长度为539 bp；NOX45’-CAG GAG GGC TGC TGA AGT ATC AA-3’和5’-TGA CTG GCT TAT TGC TCC GGA TA-3’，扩增片段长度为303 bp。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，68℃退火1 min，72℃ 延伸1.5 min，30个循环，72℃继续延伸7 min。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，加样量为4~8 μl。电泳条带采用Pharmacia Biotech凝胶成像系统分析。
1.2.5 western blotting 检测NOX4蛋白的表达去除培养液，PBS洗涤细胞两次，加入预冷裂解液200 μl孵育20 min，以上操作在冰上完成。4℃ 12 000 g离心10 min，收集上清液，测定蛋白浓度。灌注12％SDS-PAGE胶，恒压80 V电泳，待溴酚蓝染料带进入分离胶后将电流调至120 V，当溴酚蓝带到达凝胶底部时，停止电泳。350 mA进行恒流电转移1 h，用含5％封闭液封闭膜1 h，一抗室温孵育2 h，TTBS洗膜5 min，3次，加入1:3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗孵育1 h，洗膜5 min，4次，ECL化学发光法压片显影。
1.3统计学处理
所有数据采用平均数±标准差表示，用SPSS10.0进行统计处理，统计学采用单因素方差分析检验，以P＜0.05判定差异的显著性。
2结果
2.1原代HUVECs鉴定
内皮细胞Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞所特有，用免疫组化法检测到分离培养的HUVECs Ⅷ因子相关抗原为阳性，胞内可见棕颗粒，而未加一抗（用PBS代替一抗）的对照组HUVECs胞内无棕颗粒（图未给出）。结果证实了我们从人脐静脉分离得到的细胞是内皮细胞。
2.2流式细胞仪检测HUVECs内活性氧的产生
结果显示，葡萄糖处理组ROS（133±8）比正常对照组（100±5）显著增高（P＜0.05，n=3）；NOX抑制剂DPI预处理组细胞内ROS（54±6）与葡萄糖处理组相比明显降低（P＜0.05，n=3）。在甘露醇对照组，也可以观察到活性氧轻度升高（122±7），但不如葡萄糖处理组明显。见图1。
图1流式细胞仪检测HUVECs内ROS的产生
（C:正常对照组，M:甘露醇对照组，G: 高葡萄糖处理组,D: 干预组
reactive oxygen species (ros)与正常对照组相比,*P＜0.05；与葡萄糖处理组相比，#P＜0.05)
2.3 RT-PCR检测HUVECs内NOX4的mRNA表达
结果显示，高糖处理组NOX4的mRNA表达比对照组明显升高，差异具有显著性(P＜0.05)。DPI预处理组NOX4的mRNA表达比高糖处理组明显降低，差异具有显著性(P＜0.05)。甘露醇不影响HUVECs内NOX4的mRNA表达。见图2。
图2 RT-PCR检测HUVECs时对NOX4 mRNA表达
（C:正常对照组，M:甘露醇对照组，G: 高葡萄糖处理组,D: 干预组
与正常对照组相比,*P＜0.05；与葡萄糖处理组相比，#P＜0.05)
2.4 Western－blot检测HUVECs内NOX4的蛋白表达
结果显示，高糖处理组NOX4的蛋白表达比对照组明显升高，差异具有显著性(P＜0.05)。DPI预处理组NOX4的蛋白表达比高糖处理组明显降低，差异具有显著性(P＜0.05)。甘露醇不影响HUVECs内NOX4蛋白表达。见图3。
图3 Western blot检测HUVECs时NOX4蛋白表达
（C:正常对照组，M:甘露醇对照组，G: 高葡萄糖处理组,D: 干预组
与正常对照组相比,*P＜0.05；与葡萄糖处理组相比，#P＜0.05）
3讨论
体内活性氧的产生有多种来源，研究表明，NOX才是内皮细胞内ROS的主要来源，内皮细胞表达NOX家族中的NOX2和NOX4。2002年Sorescu等[6]应用定量PCR检测了内皮细胞中各种NOX mRNA的表达，发现NOX4表达水平比NOX2高20多倍。Ago等[7]最近发现在HUVECs中主要表达NOX4 mRNA，用反义核酸技术抑制NOX4的表达能显著地降低内皮细胞中ROS的生成，从而推测NOX4可能参与了内皮细胞内ROS的生成。Yano等[8]将高葡萄糖（25 mmol/L）与牛大动脉内皮细胞一起孵育3 h能显著增加细胞内ROS的生成，且加入NADPH氧化酶抑制剂能抑制ROS的生成。因此，我们设想NOX4可能在糖尿病导致血管内皮细胞损伤及动脉粥样硬化中起重要作用。
我们用葡萄糖处理及DPI预处理HUVECs后再加入葡萄糖，以甘露醇为高渗对照，用RT-PCR
及Western blot方法检测了NOX4的mRNA及蛋白表达水平。结果显示，葡萄糖能够刺激NOX4的mRNA及蛋白表达明显增加；DPI预处理

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