中性粒细胞胞外杀菌网络的研究
摘要 中性粒细胞又称为多形核白细胞（polymorphonuclear neutrophils, PMNs），是机体抵御微生物病原体入侵的第一道防线。PMNs的灭菌方式主要分为呼吸爆发和形成胞外杀菌网络（neutrophil extracellular traps, NETs），后者的效率远远高于前者。胞外杀菌网络由核酸物质和颗粒蛋白组成，在诱导因子刺激下形成网状结构，捕杀病原体，其内在杀菌机制成为近年PMNs杀菌功能的研究热点。
关键词 中性粒细胞；胞外杀菌网络；杀菌机制
Research on the Neutrophil Extracellular Traps of Polymorphonuclear Neutrophils
LIANG Ya
Guangdong Polytechnic Institute，Guangzhou 510091 Guangdong Province
Abstract Polymorphonuclear neutrophils （PMNs）are one of the first defenses against invading microbes. There are two ways for PMNs to kill bacteria, phagocytosis and neutrophil
extracellular traps （NETs）, which is much more effective. NETs are composed of DNA and protein. After the stimulation of inducing factor, NETs appear and capture the pathogens. The mechanism of NETs becomes a current research focus in the field of PMNs.
Keywords Polymorphonuclear neutrophils；neutrophil extracellular traps；bactericidal mechanism
中性粒细胞，即分叶核白细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs），胞内含呈弥散性分布的颗粒，它处于机体抵御化脓性细菌等微生物病原体入侵的第一线，在非特异性细胞免疫系统中起十分重要的作用[1，2]。PMNs具有趋化、吞噬及杀菌等功能。当病原体入侵时，PMNs被趋化性物质吸引到炎症部位，伸出伪足将病原体包裹形成吞噬泡。随着吞噬作用的开始，细胞膜紊乱引起呼吸爆发，产生大量的过氧化物及超氧化物等细胞毒性效应分子，结合胞内大量溶酶体酶，将吞噬入细胞内的细菌和组织碎片分解。PMNs在吞噬细菌等病原体后，本身随即死亡解体，释出各种溶酶体酶，损伤周围组织而形成脓肿。2004年，Max-Planck研究所Volker Brinkmann研究小组发现PMNs具有第二种杀菌机制[3]。即PMNs可以在
胞外形成由核酸物质和颗粒蛋白组成的网状结构，捕杀病原体。Brinkmann将这种结构命名为胞外杀菌网络（Neutrophil Extracellular Traps, NETs），并且发现NETs的杀菌效应远高于吞噬杀菌机制[4]，成为近年研究PMNs杀菌功能的热点。
1 NETs的组成
NETs由核酸物质组成，不含任何其他细胞骨架蛋白 [3，5，6，7]。核酸物质包括DNA和颗粒蛋白。DNA是NETs的主体部分，构成一个骨架结构从而固定各种蛋白颗粒。颗粒蛋白则包含由弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、髓过氧化酶（myeloperoxidase, MPO）等蛋白组成的来自PMNs的嗜天青颗粒（原发颗粒）、由乳铁蛋白、明胶酶等蛋白组成的继发颗粒和三级颗粒。在高分辨率扫描电镜下可观察到，NETs由平滑延伸的丝状结构组成，其直径在15nm~17nm之间；在这些平滑丝上，有一些直径大约25nm的球状结构域，它们可以成束聚集为直径达50nm的结构。透射电镜显示，NETs周围无任何膜状结构包围，而且未在NETs中发现颗粒膜蛋白CD63、胞质的膜联蛋白（Annexin I）、肌动蛋白、微管蛋白以及其他各种胞质的标志性蛋白存在[3，8]。
2 NETs的形成
PMNs被刺激后，活化而具有高吞噬性，随后形态发生一系列变化，最终形成NETs。最初，PMNs外型从球状变为扁平，胞内形成数目众多的液泡。一小时后，PMNs特有的分叶核小叶开始消失，在核膜保持完整的情况下，染体开始解旋。与此同时，内外核膜间的空腔逐渐扩大（0min, 18.8±3.9nm; 60min, 27.9±5.8nm）。大约两小时后，细胞内部分颗粒消失，核膜形成一些特殊的液泡，颗粒蛋白和核酸物质混合于液泡中。大约三小时后，绝大部分颗粒消失。在此过程中，胞内膜纷纷破裂，核酸物质和颗粒蛋白融合，但细胞质膜始终保持完整。大约220min后，大部分细胞死亡，细胞质膜破裂，高度活跃的核酸和蛋白混合物释放到胞外，展开形成可以捕杀细菌的NETs [7]。
通过形态学上的比较，PMNs最终释放NETs的这种死亡方式不同于细胞调亡和细胞坏死[7]。形成NETs的过程中，核膜解体并形成一些新的液泡，核酸物质和颗粒蛋白融合。在细胞膜破裂释放NETs前，电镜下显示细胞调亡的特征性标记磷脂酰丝氨酸（PS）并未暴露出细胞外被荧光染料染，揭示了NETs并不是由凋亡细胞产生，不同于细胞调亡。Brinkmann Buchanan等人进一步发现，人PMNs在激活后10min内已经产生NETs，该过程在时间上发生在细胞凋亡之前[4，9]。
另一方面，将NETs的产生与细胞坏死比较，研究人员在NETs中没有发现任何胞质蛋白，如：肌动蛋白和微管蛋白，表明NETs不是细胞坏死后崩解泄漏的产物[4]。Fuchs等利用活细胞成像监测单个PMNs的活动，揭示NETs的形成是一个活跃细胞程序性死亡的最后一步，细胞在死亡时才释放出NETs[7]。活的斑马鱼体内NETs在PMNs被激活后释放，该过程依赖于NADPH氧化酶的激活和活性氧（reactive oxygen species, ROS）的生成，是一个始终保持细胞完整性最后快速释放核物质的活跃过程，它使得PMNs在生命结束后仍然能实现其杀菌作用[10]。
3 NETs的功能
NETs在炎症部位大量产生，并在局部提供高浓度的抗菌分子，捕获并杀死各种病原体，快速控制病菌在体内感染，起到免疫抗菌作用[3，5，6，7]。
NETs通过局部提供高浓度的抗菌蛋白来消灭多种病原体，既能捕杀革兰氏阳性菌（如A组链球菌、金黄葡萄球菌、肺炎链球菌）和革兰氏阴性菌（如沙门氏菌和志贺氏菌），也能捕杀真菌（如白念珠菌）[4，6，9，11]。Urban等证明无论是真核病原体白念珠菌的菌丝还是酵母形式都能被NETs所捕杀[6]。进一步研究发现，在活体内受细菌感染部位产生大量N
ETs [10]；在鼠肺炎球菌性肺炎模型中，鼠的肺泡上有NETs出现[12]；以及由reactive oxygen species (ros)A组链球菌引起的鼠坏死性筋膜炎模型[13]及志贺氏菌引起的家兔痢疾模型[4]中，炎症部位均能检测到NETs的存在。Lippolis等发现，在牛乳腺炎中PMNs的吞噬作用和呼吸爆发能被乳脂和乳蛋白所阻碍，但NETs的形成却不受影响。即使在牛乳存在的情况下，PMA和伊渥霉素也能刺激牛PMNs形成NETs[14]。在人体炎症检测中也分别在阑尾炎中和先兆子痫患者体内检测到了NETs [4，15]。Gupta等的研究表明，在离体实验中胎盘合胞体滋养层微粒（synctial tropho blast of maza, STBM）和细胞因子能够分别活化PMNs形成NETs [15]。NETs能够包裹这些促炎症介质，因此有可能通过限制炎症介质弥散到邻近健康组织来调控免疫应答。
4 NETs形成的诱导因子
NETs的产生受到多种诱导因素的影响，从而造成NETs生成量不同。ROS、IL-8、LPS、补体因子5a （complementary 5a, C5a）、碳酸酐酶抑制剂（carbonic anhydrase inhibitor, CaI）、葡聚糖（β-glucan, BG）、豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13-acetate ,PMA）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GO）等多种物质都能显著激活PMNs，引发NETs的形成[3，7，10，15]。甚至使用葡聚糖（dextran）或者聚蔗糖（ficoll）从全血中分离PMNs的分离方法也可以引起细胞活化形成NETs[3]。
ROS的产生是PMNs的呼吸爆发和NETs产生的关键。最初观察到NETs现象，是在使用dextran/ficoll从全血中分离PMNs的分离过程中，PMNs被激活并产生ROS，使得未处理组的实验数据有较高的NETs阳性背景[16]。众多研究表明，细胞内ROS的增加能够激活信号通路中MAPK激酶[17-19]；阿米巴作用于人PMNs，刺激NADPH氧化酶产生的ROS能激活MAPK激酶信号通路下游的ERK1/2[20]；而超氧化物H2O2作用于小鼠PMNs，实验结果显示MAPK信号通路中ERK1/2、P38、 JNK、PKB被强劲持续激活[21]。
Fuchs等体外实验显示，用GO生成外源的H2O2刺激人PMNs，能诱导形成NETs[7]。因为H2O2可绕过NADPH氧化酶激活其下游信号通路，甚至用阻断剂抑制NADPH氧化酶活性后，GO仍能诱导NETs的产生。而H2O2的专一抑制剂过氧化氢酶（catalase, CAT）则可以完全抑制该效应，用CAT的专一性抑制剂3-氨基三唑（3-aminoamitrole, AT）处理，可以显著地促进各种刺激物诱导PMNs形成NETs，证明GO诱导NETs的产生是通过H2O2作用的。由于血清具有抗氧化作用，可以剂量依赖性地抑制NETs的形成[21]。因此，NETs的形成需要血清浓度至少低于2%的环境[7]。另一方面，用金黄葡萄球菌（S. aureus）或者PMA诱导来自慢性肉芽囊肿病患者的PMNs，都不能形成NETs。但是用GO可以激活细胞形成正常水平的NETs。因此作出推测，活化NADPH氧化酶产生ROS这一信号转导途径参与了诱导N
ETs生成的过程，并且H2O2在其中起重要作用。
5 抗NETs的机制
实验证实，许多革兰氏阳性菌外表都带有脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease, DNase） [11-13]，如肺炎链球菌和A组链球菌的外部DNase，它可以降解NETs的DNA骨架，有助病原体逃脱NETs的捕捉，提高了病原体致病性。Beiter等发现具有DNase的肺炎链球菌更容易从上呼吸道扩散到肺和血液，导致肺炎发生[12]。DNase缺陷菌株也对PMNs的杀伤更敏感，在体内外用DNase抑制剂抑制DNase活性可以显著降低病原体的致病性[13]。

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